用光生物素标记核酸探针的研究

用放射性同位素标记核酸目前还只局限在一些有条件的实验室进行。另外,放射性标记探针还有保存时间短,危害人身安全等缺点。 本文介绍用光生物素标记核酸探针的方法,它既保留了生物素标记的优点,而且比应用放射性同位素方便安全。它不用缺口翻译方法进行标记,只用可见光照射即可标记成核酸探针,不管是DNA、RNA,还是单链双链皆可进行标记。这样核酸探针标记技术被进一步简化,使其更有利于临床应用。     

生物素标记核酸探针的应用概况

目前,基因探针已用于人和家畜传染病、寄生虫病的诊断及流行病学的调查。它具有高度的敏感性,并且基因探针的检测是建立在探针和待检基因序列同源性的基础上,因此具有高度的特异性。基因探针采用的标记方法有同位素标记、生物素标记和化学修饰核酸标记。但在这之前,用得较多的仍然是同位素标记的核酸探针。然而,由于放射性同位素的应用存在着不够安全方便、实验周期长、半衰期短、价格昂贵以及污染等缺点,使分子杂交技术的推广应用受到一定程度的局限。为此,各国研究工作者一直在探讨一种非放射性的核酸标记方法。近年出现的生物素标记的核酸探针技术就是这方面的一大突破,此种生物素化的脱氧尿嘧啶苷,     

光生物素标记核酸探针检测水貂肠炎病毒的研究

水貂肠炎病毒(MEV)的检测,目前主要采用病毒分离和血清学方法。为了能直接从样品中检测病毒,我们于1988年秋冬,首次采用了光生物素标记核酸探针打点杂交的方法,结果证明这种方法效果良好,能特异地检出MEV,且灵敏度高,可检测出10pg水平的病毒DNA。     

山羊痘病毒及口疮病毒ITR-059基因双重PCR检测方法的建立

为实现山羊痘病毒(GTPV)和口疮病毒(ORFV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及ORFV的059基因,分别设计用于普通双重PCR的引物2对、用于二联实时荧光定量PCR的特异性引物及探针2套;探针分别用5′JOE-Eclipse3′及5′FAM-TAMRA3′荧光染料标记物进行标记。结果显示,所建立的GTPV-ITR-L-ORFV-059双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达10~4copies/μL DNA;所建立的ITR-059二联探针实时荧光定量PCR方法可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达10~(2.87)和10~(2.52) copies/μL DNA。本研究初步建立了可同步特异性检测GTPV和ORFV的双重普通PCR及二联探针实时荧光定量PCR检测方法。     

新城疫病毒传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒共检基因芯片的构建

本试验在前期研究的基础上,进一步构建了联合检测新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的基因芯片。克隆和鉴定了NDV-F、NDV-HN、IBV-M、IBV-N、ILTV-TK、ILTV-gB共6个基因,将其特异cDNA/DNA片段作为靶基因点制于氨基修饰的玻片上,制备了NDV-IBV-ILTV共检基因芯片阵列。以这3种病毒的核酸作为模板,引入Cy3-dCTP进行探针的PCR扩增标记,标记产物与芯片杂交,进行基因芯片的有效性评价,同时对该芯片的特异性、敏感性和稳定性进行了评价,并进行了临床初步检测验证。结果,确定了NDV-IBV-ILTV共检芯片的探针PCR扩增标记体系,确定Cy3-dCTP终浓度为100μmol/L;以禽流感病毒和传染性囊病病毒为模板制备的探针不与NDV-IBVILTV芯片杂交,NDV、IBV、ILTV之间无交叉反应;该芯片检测的灵敏度为20pg/μL;随机抽取3张不同批次制备的芯片,与NDV-F和NDV-HN的杂交结果显示,SNR均大于3。分别用该基因芯片和PCR/RTPCR检测了12份临床病料,结果显示,NDV检出率为16.67%,IBV检出率为41.67%,ILTV检出率为0,两者的检测结果一致。结果表明该检测技术能够用于NDV、IBV和ILTV快速诊断和临床病料的检测。     

钙敏感受体参与镉致原代大鼠成骨细胞损伤

为探究钙敏感受体(CaSR)在镉致原代大鼠成骨细胞损伤中的作用,本研究用不同浓度的镉(1、2、5和10μmol/L)处理原代大鼠成骨细胞3 h,或用2μmol/L镉处理成骨细胞不同时间(10 min、30 min、1 h、3 h、6 h和12 h),或用2μmol/L镉与CaSR抑制剂/激活剂共处理成骨细胞3 h。通过Western-blot检测CaSR蛋白表达水平,q RT-PCR检测CaSR基因转录水平,Hoechst33258染色观察细胞核形态变化。结果显示,不同浓度的镉处理以及2μmol/L镉处理成骨细胞不同时间,均能显著增强成骨细胞中CaSR蛋白的表达水平;镉处理显著升高成骨细胞中CaSR基因的转录水平;CaSR抑制剂可缓解镉对成骨细胞细胞核的损伤,CaSR激活剂加剧镉对成骨细胞细胞核的损伤。上述结果表明,Ca SR在镉致原代大鼠成骨细胞损伤过程中发挥着重要作用。     

磺胺甲(口恶)唑的控温相变免疫分析

将已制备的抗磺胺甲唑(SMX)单克隆抗体(AbSMX)与温度敏感水凝胶(pNIPA)偶联形成水凝胶复合物(pNIPA-AbSMX),用异硫氰基荧光素(FITC)标记的抗原(FITC-AgSMX)和游离半抗原SMX竞争地与有限量的AbSMX和pNIPA-AbSMX反应,根据水凝胶相变温度以上免疫复合物沉淀的特性进行分离,结合抗原抗体免疫反应测定SMX,建立了一种检测SMX的控温相变免疫分析方法。结果表明,SMX浓度在0.1ng/mL~100μg/mL范围内有良好的线性关系,60%抑制率时灵敏度为0.03μg/mL。     

猪和鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度的高效液相色谱-荧光检测

采用甲醇-100g/L三氯乙酸混合液(二者体积比为50:50)提取血浆中的硫酸黏杆菌素,用邻苯二甲醛进行柱前衍生。荧光检测,激发波长344nm,发射波长436nm。流动相为V乙腈:V0.01mol/L磷酸缓冲液=68:32,流速为1.4mL/min。猪、鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度为0.1～4μg/mL时,硫酸黏杆菌素与其峰面积之间存在良好的线性关系(r2=0.997),最低定量限为0.1μg/mL。血浆中添加0.1、0.5、2.0μg/mL浓度的硫酸黏杆菌素,其回收率70%,变异系数均10%。结果表明,建立的猪和鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度的高效液相色谱-荧光检测方法重复性好、灵敏度高、操作简便,可用于猪和鸡血浆中硫酸黏杆菌素浓度的测定。     

线粒体钙超载在镉致PC12细胞凋亡中的作用

为探讨线粒体钙超载在镉(Cd)致PC12细胞凋亡中的作用,用不同浓度Cd(0、2.5、5、10μmol/L)培养液分别处理PC12细胞12 h,或用5μmol/L Cd和15μmol/L钌红(MCU抑制剂,RR)共处理PC12细胞12 h。通过流式细胞术检测细胞凋亡率和线粒体钙离子水平变化,Western-blot检测Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平。结果表明,PC12细胞凋亡率和线粒体钙水平随着染Cd浓度增加显著或极显著增强(P0.05或P0.01);RR能显著抑制Cd暴露引起的PC12细胞Caspase-3蛋白活化并促进Bcl-2/Bax蛋白比值升高(P0.05),显著抑制Cd暴露引起的PC12细胞凋亡率上升(P0.05),说明线粒体钙超载参与到镉暴露引起的PC12细胞凋亡过程中并具有一定的调控作用。     

锌对镉染毒小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能损伤的抑制效应

旨在研究镉对小鼠腹腔巨噬细胞的毒性损伤及锌对镉染毒巨噬细胞免疫损伤的拮抗作用。提取雄性ICR小鼠腹腔巨噬细胞,建立体外镉染毒(20、50、100μmol/L)和锌补充(20μmol/L)模型,分别对巨噬细胞形态学、吞噬功能和炎性细胞因子表达进行检测。另外,通过饮水方式对小鼠进行镉攻毒(25、250μmol/L)和锌补充(220μmol/L),3个月后提取各组小鼠腹腔巨噬细胞,观察其形态变化和吞噬活性。结果显示,镉染毒造成小鼠腹腔巨噬细胞浓度依赖性形态和超微结构损伤,细胞吞噬功能下降和LPS诱导的炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)表达量降低。锌补充能显著提高各浓度镉染毒小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力,不同程度增强轻度(20μmol/L)和中度(50μmol/L)镉染毒巨噬细胞LPS诱导的IL-1β、TNF-α和IL-6基因表达(P0.05),但对高浓度(100μmol/L)镉染毒巨噬细胞免疫保护作用不明显。结果表明,镉染毒造成小鼠腹腔巨噬细胞浓度依赖性细胞毒性和免疫功能损伤,锌补充能显著增强镉染毒小鼠巨噬细胞的吞噬活性,恢复轻度、中度镉染毒巨噬细胞炎性细胞因子的表达水平。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和日本脑炎病毒二联基因芯片的构建与应用

针对靶基因库中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重组质粒T/PRRS-PS9、T/Y11和日本脑炎病毒(JEV)的重组质粒T/PRM/M、T/JEV-C,设计4对特异性引物,采用PCR扩增获得4个靶基因片段,并用PCR标记Cy3探针,建立了一种检测PRRSV和JEV的芯片方法。特异性试验结果显示,PRRSV、JEV之间无交叉杂交,猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒与PRRSV-JEV基因芯片无杂交反应。灵敏性试验结果显示,50μL杂交体系中探针DNA的质量浓度为0.295pg/μL时仍为杂交阳性。对从猪场收集的31份样品进行处理并用基因芯片检测,PRRSV的检出率为12.9%(4/31),JEV的检出率为9.68%(3/31),PRRSV与JEV混合感染的检出率为0(0/31)。此方法的结果与PCR的检测结果完全符合。结果表明,所建立的二联基因芯片有望成为一种快速鉴别PRRSV与JEV的新方法。     

肉食兽类细小病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立与应用

为建立检测肉食兽类细小病毒荧光定量PCR方法和探索细小病毒基因组拷贝数与病毒含量之间的相关性,在肉食兽类细小病毒VP2基因区分别设计了1对保守引物和1条TaqMan-MGB标记的水解探针,通过对貉细小病毒(RDPV)LN10-1株VP2基因上的长度为92bp的保守片段进行PCR扩增,构建标准重组质粒,由已知浓度的重组质粒通过荧光定量PCR体系建立标准曲线,建立了检测肉食兽类细小病毒基因组拷贝数的荧光定量PCR方法。结果显示,该检测方法在3.50×102～3.50×107 copies/μL范围内与Cp值呈良好的线性关系(R2可达0.999),最低检测浓度为35.0copies/μL。通过标准曲线得出RDPVLN10-1株样品的目标片段拷贝数,将拷贝数值与TCID50值进行相关性分析;分析结果显示,基因组拷贝数值与病毒TCID50值之间存在极显著的正相关关系(P<0.01),血凝效价与病毒TCID50值存在显著的正相关关系(P<0.05)。结果表明,与用血凝效价测定病毒含量的方法相比,用本试验建立的荧光定量PCR技术测得的病毒拷贝数值更能准确地代表活病毒的含量。     

铜离子在诱导鸡原代肝细胞凋亡方面及其对Drp1基因表达水平的影响

为了研究铜离子(Cu2+)在诱导鸡原代肝细胞凋亡方面及其对Drp1(dynamin-related protein 1)基因表达的影响,在无菌条件下采集13日龄SPF鸡胚肝脏,剪碎后用胶原酶消化成单个细胞,采用无血清培养法培养,在细胞对数生长期分别用终浓度为200、100和10 mol/L的Cu2+孵育细胞24 h,采用DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)的含量,采用JC-1线粒体膜电位法检测细胞凋亡,采用RT-q PCR测定Drp1基因的表达情况。结果显示,与对照组相比,200和100 mol/L Cu2+组鸡原代肝细胞凋亡数目显著增加,ROS含量显著上升且Drp1基因表达显著升高(P0.05),10 mol/L Cu2+组鸡原代肝细胞则无论ROS含量还是Drp1基因的表达均无显著差异。结果表明,髙浓度Cu2+(200和100 mol/L)通过生成大量ROS引发鸡原代肝细胞凋亡,同时使得Drp1基因表达升高,提示Drp1基因可能参与调控鸡原代肝细胞凋亡。     

猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立及其初步应用

建立了检测CSFV的快速、敏感、特异的RT PCRELISA方法。在RT PCR过程中以地高辛标记的dUTP(DIG dUTP)标记PCR产物 ,用生物素标记的捕获探针在链亲和素包被微量板孔中杂交捕获PCR产物。该方法的敏感性较常规RT PCR方法高 10 0倍 ,可检测出 35 0 μL1∶10 0 (相当于 3.5mg)的兔脾组织悬液中的C株CSFV ,特异性强 ,避免了PCR过程中因污染导致的假阳性结果。通过对RT PCR和微量杂交系统的条件优化 ,该方法用于检测C株兔脾组织毒、细胞适应毒和野毒感染的猪组织毒样品 ,效果良好     

禽流感病毒等RNA病毒鉴别基因芯片的制备

将克隆和鉴定的AIV的HA、NA、M、NS、NP基因以及NDV、IBDV,IBV的保守基因片段作为探针,同时以克隆的GAPDH基因作为阳性对照,利用芯片点样系统spotArray<'TM>24将探针与阳性对照、阴性对照和空白对照按照设计好的阵列点在基片上,制备了AIV等RNA病毒诊断芯片,并从点样条件和杂交条件两个方面进行了优化.结果显示,探针浓度在300～1 200 μg/mL时点样,Cy3-dUTP终浓度为0.05μmol/mL,杂交温度在42℃,杂交时间在8～12 h时,杂交信号比较理想.该方法对20份已鉴定的H5N1亚型禽流感病毒的检出率为100%(20/20);10份现地送检的疑似AIV样品的检出率为70%(7/10),检测结果与RT-PCR和鸡胚传代分离鉴定的符合率为100%.结果表明,制备的DNA芯片可有效诊断上述病毒.     

用生物素标记核酸探针检测牛传染性鼻气管炎病毒的研究

将纯化的牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)全基因组用缺口翻译方法把生物素—尿苷三磷酸(Biotin-dUTP)掺入双链IBRV—DNA上作为探针,与点在硝酸纤维膜上的样品进行打点杂交,然后在链霉亲合素—碱性磷酸酶中孵育,用氮蓝四唑和5—溴—4—氯—3—吲哚磷酸作用,阳性反应呈现紫色斑点。通过检测样品中IBRV—DNA同源序列,以确定是否存在IBRV。结果表明,应用生物素核酸探针可检出10pg的IBRV—DNA,具有灵敏、快速、无放射性污染、探针保存时间长等优点,为IBRV临床检测提供了一个有力的手段。     

脑心肌炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立快速检测脑心肌炎病毒(EMCV)的环介导等温扩增方法(LAMP),参照GenBank中EMCV基因组序列(X74312.1),针对EMCV的3D基因保守区域设计并合成了4条引物,对建立的反应体系进行条件优化,并进行特异性、敏感性试验及临床样本的检测。结果显示,成功建立了EMCV LAMP检测方法,且当内、外引物浓度比例为5∶1(即内、外引物浓度分别为50μmol/L、10μmol/L),反应温度为64℃,反应时间为60min时反应体系可达最佳。特异性和敏感性试验表明,该方法能够特异性地检测EMCV,且敏感性比常规RT-PCR法高10倍。分别用建立的LAMP法与ELISA法对临床样本进行检测,结果二者的符合率为97%。表明建立的LAMP方法特异性强、敏感性高,可适用于EMCV临床样本的快速检测。     

卡介菌多糖核酸对泌乳奶牛外周血PMN吞噬功能及活性氧释放的影响

为探讨卡介菌多糖核酸(polysaccharide nucleic acid fraction of Bacillus Calmette Guerin,BCG-PSN)对泌乳奶牛外周血嗜中性粒细胞(neutrophil,PMN)吞噬功能及活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放的影响,选取处于泌乳初期的健康奶牛,无菌采集颈静脉血,肝素抗凝。不同浓度的BCG-PSN(终浓度分别为0、2、5、10、40、80μg/mL)与全血共孵育2h,加入FITC标记的大肠杆菌悬液10μL,37℃20min后,放入冰水中终止吞噬反应;溶血素裂解红细胞,0.01mol/L、pH 7.2PBS洗涤2次,重悬后FL1通道检测PMN对大肠杆菌的吞噬率。不同浓度的BCG-PSN(终浓度分别为0、2、5、10、40、80μg/mL)与全血共孵育2h后,加入乙酸肉豆蔻佛波酯(phorbol myrisate acetate,PMA)刺激PMN,其中PMA刺激的终浓度为100ng/mL,同时每个浓度梯度设无PMA(等量PBS代替PMA)刺激对照;37℃作用15min后加入双氢罗丹明123(dihydrorhodam...     

填充法治疗齿瘘病

应用填充粘固剂方法治疗大家畜13例齿瘘病,其中驴8例,均收到较好效果。 将病畜牵入六柱栏内保定,头部高低应以看清楚口瘘管齿的对侧口角外。借手电之光查清瘘齿位置,以探针从外探测瘘管的方向、大小、深度,然后用0.1％锰酸钾充分冲洗管内的食物、脓血等导物,再用生理盐水冲洗,并用药棉或纱布擦净瘘管。然后配制粘固剂(采用上海牙科材料厂生产的磷酸锌粘固剂1克和     

白藜芦醇对玉米赤霉烯酮致TM4细胞氧化损伤及凋亡的保护作用

为探究白藜芦醇(RSV)对玉米赤霉烯酮(ZEA)致睾丸支持细胞氧化损伤及凋亡的保护作用,以小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞为研究对象,分别设对照组、ZEA组(20μmol/L)、RSV组(5μmol/L)、ZEA+RSV组(5μmol/L RSV处理30 min后+20μmol/L ZEA),24 h后,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测ROS水平和细胞凋亡率,试剂盒检测细胞内MDA含量和SOD活力,免疫荧光法结合流式细胞术检测线粒体膜电位(ΔΨm)变化,Western-blot检测Fas/FasL通路相关蛋白表达。结果显示,与对照组相比,ZEA极显著抑制TM4细胞活性(P0.01),增加细胞凋亡率及提高ROS、SOD和MDA水平(P0.01),并能够显著增加Fas/FasL信号通路相关蛋白FasL、FADD、Cleaved-caspase8的表达水平(P0.05),极显著增加Fas的表达水平(P0.01);与ZEA组相比,ZEA+RSV组细胞活力显著提高(P0.05),细胞凋亡率和SOD水平显著降低(P0.05),ROS和MDA水平极显著下降(P0.01),Fas、FasL表达下调(P0.01和P0.05)。结果表明,RSV可有效减轻ZEA对小鼠睾丸支持细胞的氧化损伤作用,并能够通过调控Fas/FasL通路缓解ZEA诱导的睾丸支持细胞凋亡。