抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以高浓缩的O型口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗为抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,以重组表达的O型重组VP1蛋白(O-r VP1)为筛选抗原,利用杂交瘤技术获得1株可稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株1C7,染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目;腹水的抗体效价为1︰105,质量浓度为4.7 mg/m L。1C7单克隆抗体为IgG2b亚型,相对亲和力常数为1.5 mol/L,能够与O型FMDV特异性地结合,且仅与结构蛋白VP1反应。稳定性鉴定结果表明1C7株能稳定分泌抗体。阻断ELISA试验表明1C7单克隆抗体能够被O型FMDV免疫阳性血清特异性地阻断。本研究为进一步建立O型FMDV抗体的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

基于单个B细胞抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的研制

为了建立基于单个B细胞制备抗体技术,本研究以O型灭活FMDV为抗原,采集健康C57/BL小鼠脾细胞,经过磁珠富集、流式B220+/CD38+/Ig G1+/抗原+分选,获得单个抗原特异性的B细胞。经单细胞巢式PCR反应扩增获得抗体完整轻、重链可变区序列后,分别构建轻/重链表达质粒,然后共转染HEK-293细胞后,成功获得3株特异性单克隆抗体,且证明均属于Ig G1型抗体;ELISA结果显示,获得的3株抗体均能与O型FMDV抗原结合;免疫荧光试验证明,3株抗体能够特异性结合细胞内复制的O型FMDV。本研究成功建立了基于单个B细胞直接制备抗FMDV单抗的方法,为后期开发特异性单克隆抗体打下了坚实的基础。     

口蹄疫病毒VP2蛋白特异性单克隆工程抗体的表达与活性鉴定

为了在牛上应用单个B细胞抗体技术制备口蹄疫病毒(FMDV)特异性单克隆抗体,本研究利用生物素标记O型FMDV 146S抗原,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选单个抗原特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,将可变区基因插入含有牛Ig G抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建完整Ig G抗体的表达质粒。将表达质粒转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行抗体表达与纯化。经病毒中和试验(VNT)、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot验证抗体的生物活性。结果显示,获得了4株FMDV特异性单克隆工程抗体,其中2株(A35、B57)可以中和O型FMDV;2株(A7、E32)IFA检测为阳性,其中E32可特异性结合O型和A型FMDV两种抗原,但没有病毒中和活性;ELISA结果显示,E32具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,E32可特异性结合衣壳蛋白VP2,说明在衣壳蛋白VP2存在型间保守的抗原位点,为通用型FMDV抗原检测方法的研究提供了材料。     

FMDV在BHK_(21)细胞扩增后FMDV140S抗原的测定

本文报告了用蔗糖密度梯度离心和光密度分析相结合口蹄疫 病毒(FMDV)在单层BHK_(21)细胞中扩增后,其中FMDV 140 S抗原浓度,并同时分析了经BEI(二乙烯亚胺)灭活后,这种抗原含量的改变。结果表明,O型FMDV在单层BHK_(21)细胞中增殖后,其FMDV 140 S抗原浓度达1.2μg/ml;而经BEI灭活后,其中FMDV 140 S抗原浓度降至0.9μg/ml。     

口蹄疫病毒A-O型多表位二价融合抗原的构建及其在小鼠模型中的免疫学功能

为了研制广谱高效的新型口蹄疫病毒(FMDV) A-O型重组多表位二价疫苗,以结核分支杆菌热休克蛋白70(mHSP70)的C端肽结合区作为多表位免疫原的载体蛋白,将A型和O型FMDV代表性毒株VP1上的B细胞表位以及非结构蛋白3A上的T细胞表位基因进行串联合成后与mHSP70的肽结合区编码基因相连接,构建重组质粒pAO-HSP,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白经过纯化和鉴定后免疫BALB/c小鼠,检测相应的体液免疫应答和细胞免疫应答。结果显示:重组蛋白pAO-HSP在BL21(DE3)中能够以可溶性形式表达,纯化后经Western blot检测能够与感染了A型和O型FMDV猪的阳性血清发生特异性反应,并能够刺激小鼠产生抗A-O型FMDV特异性抗体。免疫后小鼠的脾淋巴细胞在A型、O型灭活FMDV刺激后,均出现显著的增殖现象,同时可以产生相关的Th1或Th2型细胞因子。本研究成功构建重组抗原pAO-HSP,并在小鼠模型中初步显示出了良好的免疫效果,为新型FMDV A-O型多表位二价疫苗的研发奠定基础。     

三株O型口蹄疫病毒单克隆抗体的抗原识别位点分析

用抗O型口蹄疫病毒(FMDV)单克隆抗体杂交瘤细胞株(4A9、4C3、9F12)制备腹水并进行纯化,经ELISA检测,单抗4A9、4C3和9F12的腹水效价分别为1:25 600、1:102 400和1:51 200,SDS-PAGE分析显示,3株纯化单抗均以IgG重链和轻链为主,其分子质量分别约为45 ku和25 ku.单抗4A9、4C3和9F12的饱和度分别为1:40、1:40和1:1 000,叠加试验所得增值指数分别为0.27%、13.05%、13.34%,均小于50%.Western-blotting结果显示,3株单抗均可与O型FMDV结构蛋白VP1发生特异性反应.表明,此3株单抗均识别O型FMDV VP1蛋白上的同一个抗原位点,存在干扰现象.     

A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70～81位、118～140位,VP1 G-H环131～157位、C末端188～212位,A/WH/CHA/09 VP1 43～48位、VP3 55～72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。     

商品疫苗对FMDV O/YNGM/97株的免疫效果评价

利用血清学方法对我国流行毒株O/YNGM/97进行鉴定.并对其生物学特性和免疫学特性进行了研究.结果显示,该流行毒株为O型12蹄疫病毒(FMDV),其对乳鼠和BHK21细胞的适应性比较好,致病性较强,LD50.和TCID50分别为10-6.33/0.2 mL和10-4.75/0.05 mL.VP1基因序列的比较结果显示,O/YNGM/97株与国外FMDV参考毒株O/TAI/1/92的同源性为91.4%,与国内疫苗毒株OZ/93、OA/58和OY/80的同源性分别为79.2%、83.6%和78.99/6.用商品疫苗OZ株、OY株口蹄疫O型灭活疫苗和牛羊.口蹄疫O-Asial型双价灭活疫苗免疫的小鼠均可产生较高的免疫抗体,并对流行毒株O/YNGM/97的攻击具有较好的保护性.说明,使用现有商品疫苗完全可以预防该毒株在我国的流行.     

牛源A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的克隆与序列分析

提取2株A型口蹄疫病毒FMDV L1和FMDV L2的RNA,用1对通用引物经RT PCR扩增出2株病毒VP1基因的DNA片段,将扩增的VP1编码序列克隆到质粒载体pGEM TEasy中,转入大肠埃希氏菌JM109,得到大量携带目的基因的质粒;经过重组质粒的鉴定、测序获得其核苷酸序列;利用序列分析软件及系统发生树绘制软件对FMDV L1和FMDV L2以及作为参考毒株的A22/India/17/77进行序列分析。结果表明,核酸序列中的变异多发区要多于氨基酸序列,氨基酸序列最明显的变异发生在构成FMDV抗原位点1的βG βH环内,其中毒株FMDV L1和FMDV L2RGD序列中的精氨酸(R)发生了变异,分别变成了亮氨酸(L)和谷氨酰胺(Q)。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的抗原结合特性分析

为了解和确定抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体所针对的抗原表位及今后的确切用途,用竞争性结合ELISA试验结合Western-blotting分析,对10株单克隆抗体的抗原结合特性进行了分析。抗体反应增值结果表明,10株单抗针对的是同一大的抗原决定簇,根据增值结果可将10株单抗分成4个亚群。除2A1外,其他9株单抗的ELISA反应增值结果与Western-blot- ting分析结果一致,认为可能是由于2A1与其他9株单抗的免疫原不同所致。     

应用BALB/c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB/c小鼠,同时设空白对照组,每组8只。免疫后每7 d采血一次,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清抗体水平;第28 d用800LD50同源强毒攻击,攻毒后36 h,每组随机选取3只BALB/c小鼠,采全血,分别用每只BALB/c小鼠全血注射12只乳鼠,每组共注射36只乳鼠,以乳鼠试验判定BALB/c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明,免疫组BALB/c小鼠均可产生特异性抗体,保护率分别为75.0%、63.9%、36.1%;对照组小鼠血清抗体为阴性。提示,BALB/c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

口蹄疫病毒3A蛋白和FLAG标签的融合表达与血清学分析

通过对比各短肽标签,选择由8个氨基酸组成的FLAG标签弥补口蹄疫疫苗毒株OZK 3A蛋白的93～102位10个氨基酸缺失,原核表达FLAG与3A的嵌合蛋白,并命名为3AF。同时也表达了OZK毒株原始3A蛋白。分别以3A和3AF蛋白作为免疫原免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,采用ELISA和Western-blot分析融合蛋白的血清学反应活性。结果表明,3A蛋白和3AF蛋白均能在大肠杆菌中有效表达,且主要以可溶性形式表达。纯化的3AF蛋白能与FLAG单抗特异性反应而未能诱导免疫小鼠产生针对该标签的抗体,体现了体外和体内的生物反应性差异。FLAG标签对3A蛋白的表达水平、表达形式等未产生显著影响。本研究为下一步FLAG标记病毒的拯救及其应用奠定了基础。     

信号肽对O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中表达及分泌的影响

构建融合不同信号肽的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白真核表达载体,筛选不同的分泌型信号肽以提高O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)中的表达并使其分泌到CHO培养基中。通过PCR方法将10种不同的分泌型信号肽与串联表位基因的5′端相连,分别构建了真核表达载体并转染哺乳动物细胞CHO,采用Western-blot检测CHO培养基中重组表位蛋白累积量,研究结果表明,O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中成功分泌表达,不同的分泌型信号肽明显改变O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO培养基中的累积SCGB1D1 isoform信号肽介导的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达量最高。综上所述,合适的分泌型信号肽促进O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中的分泌。     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

旋毛虫单克隆抗体特性鉴定

将两株抗旋毛虫单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞（Ｄ４,Ｅ２）所分泌的ＭｃＡｂ,经纯化后电泳分析,其重链分子质量为５５ｋｕ,轻链分子质量为２９ｋｕ,符合ＩｇＧ抗体的特点。两株ＭｃＡｂ与旋毛虫阳性猪血清所针对的旋毛虫抗原决定簇相同,都不与猪的其它寄生虫发生交叉反应,与抗原的相对亲和力Ｅ２＞Ｄ４,ＭｃＡｂ亲和层析纯化抗原的分子质量为４９ｋｕ,经免疫斑点染色证明为糖蛋白。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

鹅源新城疫病毒单克隆抗体的研制及其与不同NDV毒株的反应性

以鹅源新城疫病毒(NDV)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得了5 株具有HI特性的单克隆抗体,分别命名为2G5、3A4、3B5、6B1 和8C5,其腹水HI 效价分别为214、212、29、215 和28。竞争ELISA结果表明,2G5、3A4、3B5和6B1在HN蛋白上所针对的表位属于同一抗原区,而8C5针对的表位为另一抗原区。将上述5株单抗与不同来源的NDV进行了HI排谱试验。结果显示,同一抗原区4株单抗的反应谱比较一致,而与另一抗原区单抗8C5 的反应谱明显不同。5 株单抗与鹅源NDV毒株的反应性较强,而与鸽源NDV毒株的反应性较弱。这5 株单抗用HRP标记后再与不同单抗进行交叉夹心ELISA,得到了一个新的系统(2G5 8C5)。用该系统对NDV分离株做排谱试验。结果显示,该系统与鹅源NDV分离株的反应性较好,表明所建立的新系统可用于鹅源NDV的检测。