A型口蹄疫病毒衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及免疫效果分析

为了探索更有效的A型口蹄疫(FMD)表位疫苗,根据已鉴定的A型口蹄疫病毒(FMDV)主要抗原位点,结合基因序列比对分析,选择了A型FMDV流行毒株的主要抗原位点区进行表位蛋白分子的设计表达。所用表位序列包括A/QH/CHA/2013的VP2 70～81位、118～140位,VP1 G-H环131～157位、C末端188～212位,A/WH/CHA/09 VP1 43～48位、VP3 55～72位,以及非结构蛋白3A中的T细胞表位和通用性T细胞表位,构建免疫原蛋白分子命名为ANX2和ANX3,其中ANX2采用了表位序列反向串联的方式进行设计,用大肠杆菌表达免疫原基因,纯化表位蛋白免疫小鼠和猪,分析特异性体液免疫和细胞免疫应答水平,并对免疫猪进行了攻毒保护试验,评价表位疫苗的保护效果。结果显示,ANX2、ANX3重组蛋白以包涵体表达为主,蛋白大小约为41 ku和39 ku,均能与A型FMDV阳性血清发生特异性反应;免疫小鼠和猪后都能产生抗A型FMDV特异性抗体;用表位蛋白刺激免疫小鼠脾淋巴细胞,细胞因子IFN-γ和IL-4均有明显的升高;攻毒后对猪有一定的保护作用,ANX2的免疫效果略优于ANX3,证明表位序列反向串联更有利于抗原表位的展示,从而增强其免疫效果。本研究为A型FMDV表位疫苗的研究积累了经验。     

牛A型多杀性巴氏杆菌新型保护性抗原的筛选及鉴定

为筛选牛A型多杀性巴氏杆菌新型保护性抗原,采用生物信息学方法,对牛A型多杀性巴氏杆菌Pm CQ 2基因组中功能未知基因进行分析,从中筛选出22个具有信号肽的蛋白编码基因进行克隆表达。以Pm CQ2基因组D N A为模板,22个基因经PCR扩增分别克隆到载体p ET-30a(+)或p ET-32a(+)上,转入E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测,22个基因均获得表达。W estern-blot检测发现有8个重组蛋白与感染Pm CQ2的犊牛血清具有良好的免疫反应,以其制备抗原免疫昆明小鼠,经ELISA检测免疫小鼠血清抗体水平后,采用2 LD50的Pm CQ2腹腔攻毒测定其免疫保护效果。结果表明,8个重组蛋白均能诱导小鼠产生较高水平的抗体,其中3号和9号蛋白免疫小鼠后抗体效价达到1∶12 800,且3号和9号蛋白免疫保护效果最好,免疫保护率均为30%,其余重组蛋白的免疫保护率均较低。     

A型流感病毒PB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以A型流感病毒A/Chicken/Zhejiang/YH/2/2013(H7N9)的PB1基因为模板,扩增其1519～2274bp间的片段,并构建原核表达载体pET-28a(+)-H7N9-sPB1。通过大肠杆菌原核表达获得重组蛋白His-sPB1后,以其作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合筛选获得3株能够稳定分泌单克隆抗体的细胞株5G5、2H3和5E8。Western-blot和IFA检测表明,3株单克隆抗体对于不同亚型的流感病毒均具有良好的反应性。免疫共沉淀结果表明,3株单克隆抗体能用于免疫共沉淀试验。A型流感病毒PB1蛋白单克隆抗体的制备为进一步研究PB1蛋白的结构与功能以及流感病毒的监测与诊断提供了必要的工具。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1亚区抗原性分析

采用Bac to Bac杆状病毒表达系统 ,对猪瘟病毒A抗原区内的 2 74 4～ 2 94 7nt基因片段(EC)进行了克隆、表达 ,并分析了表达产物的抗原性。研究发现 ,EC表达产物能与抗猪瘟病毒Al fort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2 4 10、a18发生特异性结合 ,且用其免疫动物后能诱导机体产生中和抗体。结果表明 ,A1抗原亚区位于E2蛋白 791～ 85 8位氨基酸区域。     

非洲猪瘟病毒C-type lectin蛋白的原核表达及其免疫特性研究

为了制备非洲猪瘟病毒(ASFV)SY18毒株的C-type lectin蛋白多抗,以基因序列优化的真核质粒为模板,扩增EP153R基因,构建原核表达重组质粒pET-32a-EP153R。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,利用IPTG诱导宿主菌表达后,纯化C-type lectin重组蛋白。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,制备C-type lectin蛋白多抗,利用Western-blot和间接免疫荧光技术鉴定该抗体的反应性和特异性。结果表明,原核表达重组蛋白C-type lectin经IPTG诱导表达成功,大小约为38 ku,其主要以包涵体形式表达,且能与His标签单抗发生反应,C-type lectin蛋白多抗可特异性识别非洲猪瘟病毒C-type lectin蛋白。本研究为非洲猪瘟血清学检测方法的建立及C-type lectin蛋白生物学功能的探究奠定了基础。     

ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP重组蛋白的表达及广谱性NDV单克隆抗体的制备

为了制备针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,采用RT-PCR方法从ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株中扩增出NP基因,并定向克隆至pET-32a-c(+)原核表达载体中,经酶切鉴定及测序验证后转化BL21(DE3)进行原核表达,用纯化得到的NP重组蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠。结果显示,成功表达出分子质量约为71ku的NP重组融合蛋白,SDS-PAGE结果显示,表达的蛋白以可溶性形式存在于菌体中。用间接ELISA方法成功筛选出2株针对ClassⅠ新城疫病毒Duck/JS/10弱毒株NP蛋白的单克隆抗体,该抗体具有良好的ELISA、IFA以及Western-blot效价。免疫特异性鉴定结果表明,获得的2株单克隆抗体具有良好的通用性,无论是ClassⅠ毒株还是两种不同基因组长度的ClassⅡ毒株,均能与其发生特异反应。     

口蹄疫病毒A-O型多表位二价融合抗原的构建及其在小鼠模型中的免疫学功能

为了研制广谱高效的新型口蹄疫病毒(FMDV) A-O型重组多表位二价疫苗,以结核分支杆菌热休克蛋白70(mHSP70)的C端肽结合区作为多表位免疫原的载体蛋白,将A型和O型FMDV代表性毒株VP1上的B细胞表位以及非结构蛋白3A上的T细胞表位基因进行串联合成后与mHSP70的肽结合区编码基因相连接,构建重组质粒pAO-HSP,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白经过纯化和鉴定后免疫BALB/c小鼠,检测相应的体液免疫应答和细胞免疫应答。结果显示:重组蛋白pAO-HSP在BL21(DE3)中能够以可溶性形式表达,纯化后经Western blot检测能够与感染了A型和O型FMDV猪的阳性血清发生特异性反应,并能够刺激小鼠产生抗A-O型FMDV特异性抗体。免疫后小鼠的脾淋巴细胞在A型、O型灭活FMDV刺激后,均出现显著的增殖现象,同时可以产生相关的Th1或Th2型细胞因子。本研究成功构建重组抗原pAO-HSP,并在小鼠模型中初步显示出了良好的免疫效果,为新型FMDV A-O型多表位二价疫苗的研发奠定基础。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ3毒株N蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

为表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ3毒株N蛋白及制备抗N蛋白单克隆抗体,将N基因克隆至原核表达载体pColdⅠ,利用大肠杆菌BL21表达出了N蛋白。将IPTG诱导的细菌反复冻融3次后超声裂解,离心后分别收集上清和沉淀,用镍柱亲和层析分别纯化,SDS-PAGE结果显示,N蛋白主要以包涵体的形式存在。用纯化的N蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞,3次亚克隆后获取1株PRRSV N单抗,命名为F4。F4可与大肠杆菌BL21、不同PRRSV分离株表达的N蛋白发生特异性反应。本试验为进一步研究N蛋白的结构、功能及建立快速诊断PRRSV方法奠定了基础。     

新城疫病毒ClassⅠ强毒株L基因的表达及单克隆抗体的制备

采用RT-PCR方法从新城疫病毒(NDV)ClassⅠ强毒株9a5b中扩增出了L基因C末端的基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,测序验证后转化入表达宿主菌BL21进行IPTG诱导表达,表达的蛋白接种8周龄BALB/c小鼠,制备L蛋白的单克隆抗体,用间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-bolt方法共同检测所获得的抗体。结果显示,重组菌可表达出分子质量约为39ku的重组融合蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。多种方法筛选显示成功制备了4株单克隆抗体。免疫特异性鉴定结果表明,在所获得的单抗中,4株单抗均具有ELISA和IFA效价,且4株单抗与ClassⅠ毒株的反应均强于与ClassⅡ毒株的反应。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定

以原核表达并纯化的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3A免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,有限稀释法进行亚克隆,获得3株能稳定分泌抗3A蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为3H2、4B1、7F5,并对这3株单抗进行了生物学鉴定。结果显示,单抗3H2和4B1为IgG2a亚型,7F5为IgG2b亚型。单抗7F5针对的表位与3H2和4B1两株单抗的表位不一致;这3株单抗均能够与FMDV特异性结合,且单抗4B1与所有3A相关蛋白均反应。稳定性鉴定结果表明,获得的3株杂交瘤细胞均能稳定分泌单克隆抗体。研究结果为进一步探索3A蛋白的结构和功能以及建立诊断方法奠定了基础。     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

口蹄疫病毒3D蛋白对DNA疫苗免疫效果的影响

将携带O型FMDVChina 99株P1 2A、部分 2B及 3C蛋白酶编码基因的真核表达质粒与在毕赤酵母中表达的纯化FMDVChina 99株 3D蛋白同时经肌肉注射方法接种豚鼠。以MTT法检测豚鼠脾淋巴细胞经植物血凝素 (PHA)刺激后的增殖活性 ,以间接ELISA方法检测血清FMDV特异抗体变化 ,并以微量中和试验检测中和抗体水平。结果表明 ,FMDDNA疫苗与 3D蛋白共同免疫豚鼠后 ,抗体水平没有明显提高 ,攻毒后的保护率为 2 5 %。     

抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备及其生物学特性分析

用灭活O型口蹄疫病毒为抗原免疫BALB/c小鼠4次后,取致敏的脾B淋巴细胞和SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合,在HAT选择培养基中培养2周,经间接ELISA法筛选,最终获得了3株抗O型FMDV的阳性杂交瘤细胞株,命名为2F1、2G7和6H4。血清学试验证明该McAbs能与FMDV抗原结合,具有高度特异性。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体 pBAD/TOPO中 ,经鉴定后得到了重组质粒 pBAD VP1。将此重组质粒转化到受体菌TOP10中 ,分别以不同浓度的诱导剂L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS PAGE和蛋白质印迹分析。结果 ,以终浓度为 0 .0 2 g/L的L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,4h后表达可达到高峰 ,表达产物大小约为 4 0ku。软件扫描结果显示 ,VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的 2 6 .3% ,能与抗FMDV抗体发生特异性反应 ,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体 ,经过洗涤后制成油乳剂疫苗 ,经皮下注射免疫豚鼠 ,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数 ,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明 ,用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体 ,并对病毒的攻击提供免疫保护。     

EgM家族蛋白诱导犬免疫应答动态ELISA检测方法的建立

为建立用重组GST融合EgM家族(EgM9和EgM123)蛋白和GST蛋白免疫的犬血清中由靶蛋白(EgM家族)产生的特异性抗体的检测方法,用GST融合EgM9和EgM123蛋白及GST蛋白为抗原,辅以弗氏佐剂分别免疫试验犬3次,100μg/只,并设GST蛋白组和PBS组为对照。三免后第2周,用羊源原头蚴进行口服感染,25 000枚/只,每周采血直至感染后第45天,以GST融合EgM9和EgM123蛋白包板,用中和反应处理血清中由GST蛋白和大肠杆菌产生的抗体,之后用间接ELISA和Western-blot方法检测血清中IgG、IgM和IgA的水平。结果显示,预处理的犬血清能去除GST蛋白和大肠杆菌诱导的抗体。二免后IgG和IgM水平达到峰值,IgG应答水平随免疫和感染仍能保持高应答水平。三免后IgG应答水平未提高。第三次免疫后IgM应答水平逐渐下降。IgA产生低的免疫应答,随免疫刺激和感染没有显著的变化。结果表明,EgM9和EgM123靶蛋白免疫犬能产生高水平的免疫应答,说明用吸收非特异性抗体监测特异性抗体的方法是可行的。     

番鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

以纯化复性的原核表达的番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σB蛋白为抗原免疫BALB/c雌性小鼠,按常规方法制备单克隆抗体,通过间接ELISA、Western-blot和免疫组织化学试验进行筛选及鉴定.结果显示,获得4株能够稳定分泌抗σB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(A3F、B2B、C3E和D2G),其亚型分别属于IgG2b、IgG2b、IgM和IgM.采用小鼠体内诱生法制备的腹水均能与MDRV的σB蛋白发生特异性反应,表明,制备的单克隆抗体能够识别天然构象的σB蛋白.     

树突状细胞对灭活口蹄疫病毒的泛素化作用

通过制备BALB/c小鼠单核细胞源树突状细胞(DC),构建了树突状细胞与灭活口蹄疫病毒(FMDV)的体外作用系统,考察树突状细胞对灭活FMDV的泛素化作用。收获荷载灭活FMDV后不同时间的树突状细胞,制备树突状细胞裂解液,用SDS-PAGE和Western-blot分析灭活FMDV抗原是否被泛素化。结果发现,在将灭活FMDV荷载于树突状细胞后的第0.5、3、6、10和20 h均可检测到分子质量约为75ku的FMDV蛋白,并且被FK2抗体标记的泛素化蛋白含量明显多于FK1抗体标记的泛素化蛋白含量。说明灭活FMDV被树突状细胞加工提呈的过程包括泛素化作用,并且泛素化蛋白主要在溶酶体内被降解。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著(P<0.05),而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。