水牛卵母细胞去核方法的比较

水牛卵母细胞体外成熟22 h后,分别用盲吸法、点击法和纺锤体成像系统(Spindleview System)去核。结果,三者的去核率分别为65．1％、81．8％和95．0％,差异极显著(P< 0．01)。以水牛胎儿成纤维细胞为供体,通过核移植构建的重构胚的融合率、分裂率和囊胚发育率, 在上述3种方法之间均没有显著差异(P>0．05)。认为点击法是一种较为简单、实用和有效的去核方法。     

供体细胞形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植效果的影响

通过采集猪卵巢表面的卵母细胞,经过体外成熟和去核,供体细胞经过分离、培养和传代,注核并构建重构胚胎,融合和激活重构胚胎,以探讨供体细胞的形态、直径和传代次数对猪体细胞核移植重构胚胎的发育能力和核移植效果的影响。结果显示,表面光滑的卵丘细胞作为供体细胞核移植后的分裂率和囊胚率均显著高于表面粗糙的卵丘细胞(P<0.05),虽然融合率差异不显著(P>0.05)。直径小于15μm的供体细胞核移植后的融合率显著低于直径大于30μm的供体细胞(P<0.05)。直径20～30μm供体细胞核移植后的分裂率与直径小于15μm的供体细胞组的分裂率差异显著(P<0.05),与直径大于30μm的供体细胞组差异不显著(P>0.05)。直径20～30μm的供体细胞核移植后的分裂率与囊胚率(63.73%和21.54%)较高,囊胚率有显著差异(P<0.05)。对不同代数胎儿成纤维细胞核移植效果的研究发现,6～9代成纤维细胞的融合率显著高于3～5代和≥10代的成纤维细胞(P<0.05),但卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05)。结果表明,表面光滑的供体细胞有利于重构胚胎的发育,直径20～30μm的供体细胞较适合进行核移植,用传代培养6～9代...     

不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞(PGCs)传代培养的影响,将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养,即A组:基础液+10 ng/mL白血病抑制因子(LIF)+10 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);B组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF;C组:基础液+20 ng/mLLIF+10 ng/mL bFGF;D组:基础液+20 ng/mL LIF;E组:基础液+20 ng/mL LIF+20 ng/mL bFGF+20ng/mL干细胞因子(SCF);F组:基础液+20 ng/mL LIF+40 ng/mL bFGF+40 ng/mL SCF;G组(对照组):基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞(BEF)饲养层上进行传代培养。结果,原代时,A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组(P<0.05),其中E和F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05),而与B、C、D组差异均不显著(P>0.05);1~8代时,B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组(P<0.05);对照组传代数仅为2代,A组为5代,而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明,在传代过程中,LIF起主要作用,20 ng/mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。     

过表达YY1对水牛早期胚胎发育及DNA甲基化的影响

为了解阴阳因子1(YY1)在水牛植入前胚胎中的表达规律及其对早期胚胎发育和DNA甲基化的影响,本研究通过受精卵卵胞质注射的方法,将线性化处理的过表达YY1质粒注射到体外受精8～10 h的水牛受精卵中,分析其对水牛早期胚胎发育的影响,并在胚胎发育各个时期检测该基因的表达。同时通过qRT-PCR检测过表达YY1对DNMT1表达的影响来研究DNA甲基化水平。qRT-PCR结果表明,YY1和DNMT1在水牛植入前胚胎的表达模式呈相反的趋势,YY1的表达随着胚胎的发育逐渐增高,囊胚期达到最高,而DNMT1基因在桑葚胚前表达较高,囊胚期表达最低。与空白对照组相比,注射25μg/mL质粒对水牛囊胚发育率无显著影响(P0.05),取得较高的表达EGFP囊胚(33.3%),显著高于5、15、50μg/mL处理组(P0.05);处理组与空白对照组的胚胎分裂率、囊胚发育率、囊胚基因表达率差异均不显著(P0.05)。过表达YY1胚胎在体外受精12 d后仍有囊胚产生。与空白对照组相比,处理组各时期胚胎中YY1和DNMT1表达量均有明显的增加。以上结果表明,过表达YY1对体外受精早期胚胎发育没有影响,但会延迟囊胚的形成。     

不同培养液对牛孤雌生殖胚胎和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

采用体外成熟的牛卵母细胞 ,经 5 μmol/LIonomycin 5min和 2mmol/L 6 DMAP 5 μg/mLCCB 4h激活 ,分别在TALP M 199(TM ,1∶2 )、BMOC M 199(BM ,1∶2 )和CR1aa培养液内培养 ,2 4h和 3 6h各组卵母细胞的卵裂率分别为5 6.4%、5 5 .6%、5 3 .6%和 72 .0 %、75 .9%、79.0 % ,无显著差异 (P >0 .0 5 ) ;培养 8d后囊胚发育率分别为 18.2 %、2 1.4%和 2 9.3 % ,CR1aa内培养孤雌生殖胚的囊胚发育率显著高于TM (P <0 .0 1)。皮肤成纤维细胞构建的重组胚经同法激活后 ,分别在TM、BM和CR1aa内培养 ,2 4h和 3 6hBM和CR1aa内重组胚的卵裂率显著高于TM (4 9.7%、49.8%比 2 0 .5 % ;74.1%、73 .2 %比 5 0 .0 % ) (P <0 .0 1) ;虽然培养 8d后各组胚胎的囊胚发育率无显著差异 ,但CR1aa内重组胚的囊胚发育率稍高 (12 .3 %比 9.8%、11.5 % )。结果表明 ,CR1aa更适合孤雌生殖和体细胞核移植胚胎的体外培养。     

铅镉联合对体外培养大鼠肾小管上皮细胞存活及凋亡的影响

采用机械筛网结合酶消化法建立了大鼠原代肾小管上皮细胞培养模型,在传代细胞增殖活性最强时间段进行铅、镉单独染毒或联合染毒.通过CCK-8还原法和流式细胞仪检测不同时间铅、镉对细胞存活率和凋亡率的影响.结果显示,铅、镉单独染毒高剂量组从第6 h开始、低剂量组从第12 h开始,其细胞存活率显著低于对照组(P＜0.05);铅、镉联合染毒组从第3 h开始,细胞存活率显著或极显著(P＜0.05或P＜0.01)低于对照组,且存活率的降低幅度与剂量呈正相关;染毒后第12 h,各组的凋亡率均极显著高于对照组(P＜0.01),铅、镉联合染毒组的细胞凋亡率显著高于各相关单独染毒组(P＜0.05),呈明显的剂量-效应关系.     

紫外线照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎体外发育的影响

分析了紫外线 (ultraviolet,UV)照射对牛孤雌激活卵母细胞和体细胞核移植胚胎卵裂和体外发育的影响。结果发现 ,经UV照射 2 0s和 40s的卵母细胞孤雌激活后的卵裂率和囊胚发育率都极显著低于UV照射 0s和 1 0s的卵母细胞 (P <0 .0 1 ) ,表明UV照射卵母细胞超过 2 0s降低了孤雌激活胚胎的卵裂和体外发育潜力。核移植中UV照射卵母细胞 2 0s后 ,重组胚的卵裂率极显著低于卵母细胞照射 0s和 1 0s时所构建的重组胚 (P <0 .0 1 ) ,但囊胚发育率无显著差异 (P>0 .0 5 ) ;而UV照射卵母细胞 40s时 ,所构建的重组胚的卵裂率和囊胚发育率都明显低于其他各组 ,表明超过 2 0s的UV照射显著降低了重组胚的卵裂和体外发育潜力。研究结果表明 ,核移植中用UV指导卵母细胞去核时UV照射时间应控制在 2 0s以内 ,UV照射 1 0s对核移植胚胎的发育不产生任何负面影响     

大片吸虫ESP对水牛外周血单核/巨噬细胞NO表达的影响

为探讨水牛易感大片吸虫的免疫机理,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离水牛外周血单个核细胞,再经贴壁法纯化单核/巨噬细胞,用Geriss法检测在大片吸虫分泌排泄产物(ESP)或脂多糖(LPS)作用下,水牛外周血单核/巨噬细胞一氧化氮(NO)的表达量。结果显示,大片吸虫ESP或LPS都可单独作用刺激水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO。大片吸虫ESP(0.1、1μg/mL)和LPS(0.1μg/mL)联合作用时水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的量低于LPS(0.1μg/mL)单独作用时的量,差异显著(P<0.05)。大片吸虫ESP(10μg/mL)和LPS(0.1μg/mL)联合作用时水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的量与LPS(0.1μg/mL)单独作用时差异不显著(P>0.05)。结果表明,大片吸虫ESP或其中组分能抑制水牛外周血单核/巨噬细胞产生NO的作用,这可能是水牛易感大片吸虫的一个原因。     

PTD-FNK蛋白对水牛精子的冷冻保护作用

PTD-FNK蛋白可以穿透细胞膜进入细胞内发挥抗凋亡作用,抵抗各种不利因素造成的细胞死亡,但国内未见将其加入水牛精液稀释液抑制精子冷冻凋亡的报道。本试验中,在水牛精液冷冻稀释液中添加不同浓度(0、0.1、1、10、100 nmol/L)的PTD-FNK蛋白,冻后检测精子常规质量指标的同时检测精子凋亡相关基因(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因)mRNA表达和Caspase-3蛋白酶的活性;最后以最优PTD-FNK蛋白浓度批量生产冷冻精液,选择50头广西地方母水牛进行人工授精试验。结果显示:①1 nmol/L组精子质膜完整性和10 nmol/L组精子活力显著高于对照组(P<0.05),1 nmol/L组精子活力和1、10 nmol/L组精子活率极显著高于对照组(P<0.01),而100 nmol/L组精子活率却极显著低于对照组(P<0.01);②1 nmol/L PTD-FNK蛋白显著降低冻后精子Caspase-3 mRNA表达(P<0.05);③人工授精后第60天受胎率达60%,略高于其他研究者取得的受胎率(56.25%,P>0.05)。总之,PTD-FNK蛋白可以显著提高水牛精子冻后质量,其机制之一可能是它显著抑制了冻后精子Caspase-3 mRNA的表达;以PTD-FNK蛋白冷冻的水牛精液实施人工授精后可以取得比现有水平更高的受胎率。     

不同制备方法对鸡胚成纤维细胞产量的影响

采用传统法、半胚法和全胚法制备鸡胚成纤维细胞 (CEF)单层 ,在同等条件下均以成纤维细胞为主 ,并伴有少量的上皮细胞 ,仅有全胚法含有极少量的肝细胞 ;培养时细胞贴壁和生长状况 3种方法无明显差异 (P >0 .0 5 ) ;CEF的产量 ,半胚法明显高于其他 2种方法