鸡烟曲霉菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡烟曲霉菌快速检测方法,根据GenBank已发表的benAfum基因序列设计1对特异性引物,建立了检测烟曲霉菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对烟曲霉菌分离株进行了检测。结果显示,该方法灵敏度高,对烟曲霉菌最低检出量为10 copies/L;重复性好,变异系数在0.7%~0.8%之间;特异性强,与黄曲霉、土曲霉、黑曲霉、塔宾曲霉及白色念珠菌等病原菌无交叉反应;该方法操作简单、耗时短,只需2 h即可完成整个试验过程。上述结果表明,该方法可应用于烟曲霉菌感染的快速检测。     

快速检测奶牛乳房炎四种病原菌的多重PCR方法的建立及应用

奶牛乳房炎是目前世界上困扰奶牛业经济效益及其发展的主要疾病之一。由于现有的检测手段繁琐复杂,所以急需一种特异敏感的检测手段对奶牛乳房炎进行快速、准确的诊断。本试验参照G en Bank发表的序列,在大肠杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌各自保守的16-23S r RN A区域及白色念珠菌的18S r RNA区域设计了4对特异性引物,建立了检测大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和白色念珠菌等4种乳房炎主要致病菌的多重PCR方法。结果表明:本试验建立的多重PCR方法具有较好的特异性和敏感性,对参与试验的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌及白色念珠菌均能扩增出各自的阳性条带并且多重PCR检测的敏感度分别为1×102CF U/mL、1×104CFU/mL、1×105CFU/mL和1×102 CFU/mL。     

禽白念珠菌基于SYBR Green Ⅰ染色的LC-PCR检测方法的建立

为建立禽白念珠菌便捷、特异和灵敏的检测方法,根据Gen Bank已发表的白念珠菌r DNA间转录间隔区核苷酸序列设计一对目的扩增子长度为273 bp的特异引物,采用Light Cycler实时PCR(LC-PCR)检测方法,以SYBR GreenⅠ为扩增产物荧光染色剂,对禽白念珠菌疑似病例血液样本进行检测,并用临床常见的5种病原真菌对该方法的特异性进行检验。结果显示,该方法灵敏度高,白念珠菌最低检出浓度为1×101CFU/m L;特异性强,与光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、烟曲霉等病原真菌无交叉反应;耗时短,只需2 h即可完成整个试验过程。总之,该方法可应用于禽白念珠菌早期侵染的方便、准确检测,为禽白念珠菌病的及时正确防治提供可靠的依据。     

光滑念珠菌SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立光滑念珠菌快速准确灵敏的检测方法,根据GenBank已发表的光滑念珠菌rDNA内转录间隔区核苷酸序列设计1对特异性引物,应用SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测光滑念珠菌,对临床分离的多株不同来源光滑念珠菌病料进行检测,通过临床常见的5种病原真菌对该方法的特异性进行检验,并用人工感染小鼠的血液、肝脏组织样本对所建方法进行检验。结果显示,该方法灵敏度高,光滑念珠菌的最低检出浓度为10 copies/μL,特异性强,与白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、烟曲霉菌等病原菌无交叉反应。该方法操作简单,耗时短,只需1 h即可完成全部检测过程。上述结果表明,SYBR Green荧光定量PCR可应用于光滑念珠菌早期侵袭的快速检测,为光滑念珠菌病的及时正确防治提供了可靠依据。     

家兔须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立家兔须癣毛癣菌快速检测方法,根据GenBank上已发表的须癣毛癣菌rDNA内转录间隔区核苷酸序列设计了1对特异性引物,建立了检测须癣毛癣菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床分离的须癣毛癣菌和病料进行检测。结果显示,该方法灵敏度高,对须癣毛癣菌的最低检出量为10copies/μL;特异性强,与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应。该方法操作简单,耗时短,只需2h即可完成整个试验过程。提示该方法可用于须癣毛癣菌的检测。     

猪四种呼吸道病原菌四重PCR检测方法的建立与应用

为建立可同时快速检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、副猪嗜血杆菌(Hps)、胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌(Pm)的四重PCR方法,根据Bb的fla基因、Hps的16S rRNA基因、App的apxⅣ基因和Pm的特异性基因KMT1设计4对特异性引物,基于TaKaRa公司的Premix Taq PCR预混酶,对四重PCR的引物浓度和退火温度进行优化,确定该四重PCR的反应体系和反应条件,通过对特异性及同一种病原菌不同血清型检测的通用性、敏感性和重复性评价,建立快速检测猪这4种呼吸道病原菌的四重PCR方法,同时应用该方法对81份临床样本进行检测,检测结果与这4种病原菌单项PCR检测以及4种病原菌的分离鉴定结果进行比较。结果表明,该方法能同时对这4种病原菌进行检测,特异性和通用性好、重复性好,对这4种病原菌DNA的最低检测质量浓度为20 pg/L,对这4种细菌的最低检出量分别为1×10~3CFU/mL的Pm,1×10~2CFU/mL的Hps、Bb和App,敏感性高。81份临床样本的四重PCR检测结果和单项PCR检测结果一致,PCR检出率明显高于细菌分离鉴定结果。本研究成功建立了可同时检出猪支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的四重PCR方法,该方法可用于临床样本的快速检测以及这4种病原菌的鉴别检测。     

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC)。人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g。样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100~5.8×100CFU/mL(或CFU/g)。试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染。     

鉴别猪胸膜肺炎放线杆菌2/6/8/12型的多重PCR方法的建立

为快速准确鉴别猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清2、6、8、12型,从已发表的文献中筛选出4对引物,通过扩增体系和扩增程序的优化来建立APP血清2、6、8、12型的多重PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果发现,所建立的多重PCR方法特异性良好,对APP血清1～15型进行PCR检测,除血清2、6、8、12型外,均不能扩增出任何条带,检测猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪大肠杆菌也呈阴性,对APP血清2、6、8、12型的细菌纯培养物、组织样品的检测敏感性分别都为1×10~3CFU/mL、1×10~3CFU/g。本PCR方法快速有效,可在4.5 h左右直接从肺脏组织中得到检测结果。本方法的建立为APP的分子分型和流行病学调查提供了有力的技术支撑。     

山羊皮下脓肿病原菌三重PCR检测方法的建立与应用

为同时检测伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌3种引起山羊皮下脓肿的主要病原菌,选择针对这3种病原的特异性引物,经条件优化后建立一种可同时检测以上3种病原菌的三重PCR方法,评价了该方法的特异性和敏感性,并检测了临床样品。结果显示,所建立的三重PCR方法仅对伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌及化脓隐秘杆菌这3种目的病原菌DNA产生阳性扩增,对大肠杆菌等其他9种微生物的DNA扩增结果均为阴性,具有较强的特异性。该方法同时显示较高的敏感性,对伪结核棒状杆菌、金黄色葡萄球菌和化脓隐秘杆菌基因组DNA的检测下限分别为1.0×103、1.1×103和6.7×102copies;对3种病原菌菌液的检测下限分别为8.7×102、1.1×102和5.1×102CFU/mL。该方法能从临床样品中检测到相应病原,其结果与单一PCR方法一致。本研究中建立了同时检测山羊皮下脓肿主要病原菌的特异和灵敏的三重PCR方法,为该病的快速诊断提供了有用的技术手段。     

大肠杆菌O157及其Stx2免疫胶体金层析检测方法的建立

建立了大肠杆菌O157和志贺毒素2(Stx2)的双抗体夹心免疫胶体金层析法,并运用该方法对上海市兽医生物技术重点实验室保存的已鉴定的58株大肠杆菌进行了检测,评估了其特异性、敏感性和重复性.结果显示,大肠杆菌O157层析法的敏感性为1×105CFU/mL,特异性为87.5%,批间和批内变异系数分别为8.6%和0;Stx2层析法的检测下限为200μL细菌培养液,特异性为50.0%,批间和批内变异系数分别为50.0%和33.0%.表明,该免疫胶体金层析法能快速、简便、特异地检测大肠杆菌O157;结合对Stx2的检测,能快速检出产Stx2的大肠杆菌O157菌株.     

鸭疫里默氏杆菌16 S rRNA PCR快速检测方法的建立

根据GenBank中的鸭疫里默氏杆菌(RA)1～19型16 S rRNA基因序列,分别与大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的16 S rRNA基因序列对比,设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16 SrRNA的PCR检测方法.结果表明,用该方法对鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、巴氏杆菌进行检测,只有鸭疫里默氏杆菌的DNA能扩增出680 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;测序结果与GenBank中鸭疫里默氏杆菌相应序列完全一致;同时分别将鸭疫里默氏杆菌基因组DNA和菌液10倍稀释进行PCR扩增,对鸭疫里默氏杆菌DNA的最小检出量为1.907×10~(-5)g/L,对鸭疫里默氏杆菌菌液的最小检出量为1.5×10~4CFU/mL.证实,建立的基于鸭疫里默氏杆菌16 S rRNA的PCR检测方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于鸭疫里默氏杆菌感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定.     

牛支原体牛多杀性巴氏杆菌与牛传染性鼻气管炎病毒三重PCR方法的建立与初步应用

为建立一种可同时检测牛支原体(MB)、多杀性巴氏杆菌(PM)与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的三重PCR检测方法,笔者设计1对特异性引物,引用文献的2对引物,对反应条件与反应体系进行优化,建立了一种三重PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行了验证。结果显示,最佳退火温度为51.7℃,最佳引物终浓度均为0.5μmol/L;敏感性结果显示,MB、PM、IBRV的最低检出限分别为3.9×10^-3ng/μL、6.61×10^-2ng/μL与2.97×10^-2ng/μL;特异性结果显示该方法只能特异性检测出MB、PM和IBRV。利用建立的三重PCR方法对108份临床病料进行检测,结果与单一PCR一致。结果表明,该方法可用于临床快速检测MB、PM、IBRV。     

奶牛乳房炎三种主要链球菌多重PCR检测方法的建立

链球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原菌,其中无乳链球菌(S.agalactiae)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)和乳房链球菌(S.uberis)是奶牛乳房炎主要的致病性链球菌。为同时、快速地检测牛奶样品中这3种重要链球菌,本研究根据无乳链球菌sip基因、停乳链球菌Mig基因及乳房链球菌pauA基因设计特异性引物,同时以细菌16S rRNA基因为内参,建立了多重PCR检测方法,并进行条件优化。结果显示,该方法最佳退火温度为58℃,最佳扩增循环数为25个循环,本方法同时检测无乳链球菌、停乳链球菌及乳房链球菌时,检测限分别为1×10³CFU/m L、1×10³CFU/m L及1×10⁴ CFU/m L,灵敏性高。该方法对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、单核细胞增生李斯特菌等10种菌均无交叉反应,特异性好。模拟样品结果显示,当奶样中3种菌的初始浓度均为1 CFU/m L时,37℃增菌6 h即可检出乳房链球菌,增菌8 h以上3种菌可全部检出。结果表明,该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对同时快速检测...     

丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法的建立

为建立高效快速的丹毒丝菌属荧光定量PCR(SYBR Green real-time PCR)检测方法,根据丹毒丝菌属16S r RNA基因保守序列设计特异性引物,通过优化确定最佳反应条件,并进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了丹毒丝菌属荧光定量PCR检测方法。结果显示,标准品浓度在1.06×106~1.06×101copies/L范围内具有良好的线性关系,最低可检测到1.06×10-2 copies/L的标准品阳性质粒;该方法与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌等22种细菌和病毒无交叉反应;批内和批间的变异系数(CV)均小于3%。对临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性强、稳定性好、准确度高和检测快速等优点,可用于猪丹毒杆菌感染的早期诊断、样品的快速检测与定量分析。     

塞内卡谷病毒荧光RT-RPA快速检测方法的建立

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术建立快速检测塞内卡谷病毒(SVV)的实时荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,能准确检测SVV核酸,与水泡性口炎病毒(VSV-IND和VSV-NJ)、猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,本试验中最低可检测SVV核酸浓度为1.35×10~(-3)g/mL;简便快速,反应时间小于20 min;重复性好。利用所建立方法对116份临床样品进行检测,结果与实时荧光RT-PCR一致。本研究为SVV防控提供了一种快速检测的新方法,可用于基层实验室对SVV的快速检测。     

定量PCR快速鉴别念珠菌种方法的建立

由于禽类念珠菌种类多样,具有条件致病和感染症状非典型的特性,在临床上区分定植和感染状态并确诊何种念珠菌感染是困难的。为了快速准确地检测禽类念珠菌感染和鉴别病原种类,本研究借助Primer Express 6.0软件设计目标念珠菌基因组DNA的种特异引物,采用real-time qPCR技术,通过检测不同念珠菌种的菌株培养物而建立鉴别方法,并用人工感染鸡的血液和肝脏样本对建立的方法进行检验。结果,成功找出三种念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌)的3对特异引物和1对共用引物;特异引物分别形成相应种的特异熔解曲线,共用引物形成对应于3个种且明显分开的三条熔解曲线,与参照病原菌无交叉反应;该方法对念珠菌样本检测最低限度可达1×10~1copies/L以下,敏感度高于常规PCR约100倍以上;同种念珠菌不同模板浓度Tm值不变,同一浓度3个重复C_t值的变异系数小于2.5%,说明离散度较低,重复性好。所建方法可以通过对感染鸡的血液和肝脏样本的检测确定目标念珠菌感染和病原种类,检测周期约2～3 h。综上,通过适当的引物设计,采用定量PCR技术可以在一定范围内快速、准确、定量地检测和鉴别感染样本中的目标念珠菌种类。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

布鲁氏菌免疫磁珠qPCR检测方法的建立及应用

为建立高效、快速和准确检测布鲁氏菌病原的免疫磁珠qPCR方法,本研究根据GenBank已经发表的布鲁氏菌流产株BRS 19 ku外膜蛋白(Omp19)基因组序列来设计qPCR方法所需要的引物和探针,利用免疫磁珠富集浓缩样品中少量的布鲁氏菌病原,建立了布鲁氏菌免疫磁珠qPCR检测方法。采用qPCR方法对免疫磁珠分离的布鲁氏菌的敏感性、特异性、稳定性及临床应用进行了研究。结果显示,免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌的最低检测限为1×10~3CFU/mL。该方法可以扩增不同种型布鲁氏菌,对其他细菌没有发生交叉反应。该方法的批内和批间的变异系数均低于10%,具有较高稳定性。免疫磁珠qPCR方法与常规qPCR的符合率为94.74%,具有良好的吻合性。上述结果表明,本研究建立的免疫磁珠qPCR方法检测布鲁氏菌具有较高的敏感性、特异性和稳定性,为布鲁氏菌病的准确诊断检测和流行病学调查提供技术支撑。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10~8～2.31×10~2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10~1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10~5～1.54×10~6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。