Ea3-1E与mChIL-15融合基因的构建及其真核表达质粒的免疫效果

应用重叠扩增PCR技术将鸡堆形艾美球虫子孢子表面抗原3-1E基因片段(Ea3-1E)与编码鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL-15)进行串联连接,并在这2个基因片段之间引入4个柔性连接肽SPGS,获得融合基因Ea3-1E-linker-mChIL-15。以pcDNA3.1(+)为载体构建并鉴定真核表达质粒pcD-NA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15。应用磷酸钙法将质粒体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。将重组质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15、pcDNA3.1-Ea3-1E和pcDNA3.1分别于14和21日龄经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄时,除非免疫非感染组外,各组感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒的免疫保护效果。结果显示,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后第30小时可检测到融合基因编码蛋白在293T细胞中的瞬时表达。与质粒pcDNA3.1-Ea3-1E相比,质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15二次免疫后可提供明显的抗球虫免疫保护效果,提高相对增重率(96.48%),降低卵囊排出率(68.35%),降低十二指肠病变记分等。抗球虫指数为183.78。     

鸡柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2对其他球虫的交叉保护力

将柔嫩艾美球虫DNA疫苗pcDNA4.0(c)-pEtK2-IL-2以50μg分别对14日龄和21日龄雏鸡进行胸部肌肉注射免疫,28日龄对各未免疫组与免疫组鸡分别口服接种柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾美球虫孢子化卵囊,36日龄剖杀,分析比较免疫保护效果.结果显示,柔嫩艾美球虫攻毒免疫试验组与柔嫩艾美球虫攻毒未免疫对照组比较,增重、盲肠病变记分、OPG值差异显著(P＜0.05),免疫保护效果明显,抗球虫指数(ACI)达186.50;而巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和毒害艾美球虫攻毒免疫试验组的ACI分别为147.85、142.71和153.82,增重、盲肠病变记分、OPG值和ACI与相应的攻毒未免疫对照组比较,均有不同程度改善,免疫保护效果不明显.表明,该DNA疫苗对柔嫩艾美球虫的攻击具有完全免疫保护作用,而对巨型艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫的攻击具有部分交叉保护力.     

鸡柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株3-1E基因的重组表达及其表达产物的免疫保护性

应用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子表面抗原3-1E基因,再克隆至质粒载体pMD18-T中,获得重组质粒pMD18-T-3-1E,采用EcoR I+Hind III双酶切法及PCR扩增鉴定正确后,将3-1E基因cDNA目的片段亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a-3-1E,用EcoR I+Hind III双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确.表达蛋白的SDS-PAGE分析表明,表达产物与预期大小(36.47 ku)一致,为可溶性表达.对诱导时间以及IPTG浓度的优化结果表明,当诱导6 h且IPTG浓度在0.8 mmol/L时表达量最大.Western-blot分析表明,表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异性识别.将重组3-1E蛋白纯化后分为肌注蛋白组和肌注蛋白加弗氏完全佐剂组免疫AA鸡,通过计算抗球虫指数检测其保护力.结果显示,肌注重组蛋白组与肌注重组蛋白加弗氏完全佐剂组均能刺激鸡体产生一定的免疫反应,对柔嫩艾美耳球虫感染产生有力的保护,其中后者优于前者,表明该重组3-1E蛋白具有研制成亚单位疫苗的潜力.     

堆形艾美球虫广东株3-1E基因在毕赤酵母中的表达

以重组质粒pGEM-3-1E为模板,扩增了序列两端分别含有EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点的堆形艾美球虫(Eimeria acervulina)广东株3-1E基因(长度为529 bp),将3-1E基因克隆至巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαC中,构建了酵母表达质粒pPICZαC-3-1E。转化毕赤酵母X-33得到含有3-1E基因的重组酵母,甲醇诱导产生的目的蛋白经SDS-PAGE分析和免疫印迹检测,表明毕赤酵母成功表达了3-1E基因。     

日龄和感染量对柔嫩艾美球虫感染鸡组织病理学变化的影响

采用组织切片技术,观察了用不同剂量柔嫩艾美球虫(E.tenella)YL株孢子化卵囊感染的同一日龄雏鸡和用同一剂量柔嫩艾美球虫YL株孢子化卵囊感染的不同日龄雏鸡的组织病理学变化,并对不同组别的卵囊和配子体数量进行了统计。结果显示,不同剂量组中,1×105卵囊感染组配子体和卵囊的产量明显高于1×103和1×104卵囊感染组,其组织病理学变化也明显,但在感染后第9~11 d,1×103和1×104感染组卵囊数较1×105组多;同一剂量(每只鸡1×103卵囊)感染时11日龄雏鸡的组织病理学变化明显,说明鸡的日龄越大卵囊产量越高。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

堆型艾美球虫表面抗原基因cSZ1在大肠埃希氏菌中的表达

根据已克隆的堆型艾美球虫 (Eimeriaacervulina)广东株子孢子表面抗原基因cSZ1的cDNA序列设计了特异性引物 ,用PCR方法扩增cSZ1的开放阅读框架 (ORF)后克隆至表达载体pET 32a( ) ,构建了重组表达质粒 pET 32a( ) cSZ1,并将其转化至大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)。经IPTG诱导 ,获得了cSZ1重组抗原在大肠埃希氏菌中的高效表达 ,表达产物量可达菌体总蛋白的 9.3% ,融合蛋白的分子质量约为 4 0ku。重组菌诱导表达的产物经SDS PAGE后 ,用堆形艾美球虫感染鸡的超免疫血清进行免疫印迹分析 ,结果为阴性 ,提示cSZ1所编码的抗原可能主要是T细胞抗原表位     

小鼠Ghrelin基因真核表达质粒的构建及对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

为构建小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒,并研究Ghrelin对3T3-L1细胞增殖的影响,以小鼠肠cDNA为模板,通过PCR扩增Ghrelin基因,插入到pMD18-T克隆载体中。对经鉴定的重组质粒pMD-Ghrelin进行双酶切,将目的基因连接到经同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(+)上。重组质粒经双酶切分析和测序鉴定后,用Lipofectamine 3000转染试剂将重组表达质粒转染到3T3-L1细胞中,采用qRT-PCR和Real-time PCR检测Ghrelin基因在3T3-L1细胞中的表达。采用CCK-8法检测细胞的生长活力;流式细胞术检测Ghrelin基因对细胞周期和凋亡的影响;采用Real-time PCR检测部分周期相关基因的mRNA表达水平。结果显示,成功构建了小鼠Ghrelin基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Ghrelin,并能在3T3-L1细胞中得到很好地表达,其表达倍数是空质粒组的5倍(P0.01);转染后第48、72和96小时,Ghrelin转染组3T3-L1细胞的生长活力明显高于空载体组(P0.05或0.01);转染后第24小时,Ghrelin转染组S期细胞数量明显高于空载体组(P0.05);Ghrelin过表达对3T3-L1细胞的凋亡无明显影响(P0.05)。qRT-PCR结果显示,Ghrelin转染组细胞的c-myc(P0.05)、E2F1、CDK2(P0.05)等mRNA的表达量也明显高于空载体组,P53表达低于空载体组,差异显著(P0.05)。以上结果表明,Ghrelin过表达能显著促进3T3-L1细胞的增殖,但不影响凋亡。     

携带禽流感病毒DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门菌的免疫效力

将从重组质粒pVAX1-HA中扩增的HA基因和从pVAX1-HA-CpG中切出的HA-CpG基因分别克隆入pcDNA3.1(+)载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-HA-CpG。将上述重组质粒分别转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验检测发现HA基因可在COS-7细胞中表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pcDNA3.1-HA)和SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)。将重组菌分别以5×109CFU口服免疫1日龄鸡2次,重组菌免疫组产生的小肠黏膜抗体效价与空载体组及油乳剂灭活疫苗组间存在显著差异。攻毒免疫保护结果表明,SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)免疫组与空载体组之间存在显著差异,而SL7207(pcDNA3.1-HA)免疫组则与空载体组间无显著差异,说明CpG可增强DNA疫苗的免疫效果。     

黑龙江省哈尔滨地区鸡球虫的区系调查

在哈尔滨地区采用群体采样法分别从6个区218个鸡场采集新鲜粪样,经饱和盐水漂浮法检查,有136个鸡场感染艾美球虫,感染率为62.39%,表明哈尔滨地区鸡球虫感染现象比较普遍.经临床症状及卵囊形态观察,共检出6种艾美球虫,分另q是柔嫩艾美球虫、堆形艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、和缓艾美球虫与巨型艾美球虫,其中柔嫩艾美球虫为哈尔滨地区鸡球虫病病原的优势虫种.     

柔嫩艾美球虫裂殖子的分离纯化

采用标准分样筛过滤、离心洗涤、差速离心和DEAE 5 2纤维素柱层析法对球虫裂殖子进行了纯化 ,并对不同填充高度的DEAE 5 2纤维素层析柱的纯化效果进行了比较。结果表明 ,采用填充高度为 14cm的层析柱分离纯化效果较好 ,操作程序较简单 ,从 30只鸡的盲肠黏膜中纯化裂殖子 1.85× 10 7个 ,平均每只鸡获得裂殖子 6 .17× 10 5个 ,所获得的裂殖子杂质极少 ,其纯度适用于mRNA差异显示等分子生物学研究。     

鹅艾美球虫致病性的研究

按每只鹅3×104和0.5×104个孢子化卵囊的剂量感染18日龄天山白鹅,以临床症状、肉眼病变、病理组织学变化、平均增重、病变记分和死亡率为观察指标,对鹅艾美球虫(Eimeria an-seris)的致病性进行了研究。结果显示,不同剂量感染引起的临床症状和各病死鹅的肉眼病变基本相似。各感染组的平均增重与对照组均差异显著(P<0.05)。各感染组平均病变记分与未感染对照组差异极显著(P<0.01);感染相同剂量组之间的平均病变记分差异不显著(P>0.05),感染不同剂量组之间的平均病变记分差异显著(P<0.05)。不同感染剂量组均发生死亡,死亡率分别为10%~30%和60%~90%。结果表明,E.anseris具有极强的致病性。     

柔嫩艾美球虫对复方抗球虫制剂抗药性的诱导

柔嫩艾美球虫(Eimeriatenella)敏感株在复方抗球虫制剂剂量递增的情况下,经过10次传代,诱导出其对复方抗球虫制剂的抗药性;经过8次传代,诱导出柔嫩艾美球虫抗氯嗪苯乙氰株对复方抗球虫制剂的抗药性。与单一用药相比,柔嫩艾美球虫对复方抗球虫制剂的抗药性产生较慢,复方抗球虫制剂控制柔嫩艾美球虫敏感株的效果比控制抗氯嗪苯乙氰株的效果要好。     

毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA文库的构建

为构建毒害艾美球虫孢子化卵囊cDNA表达文库,用Trizol试剂提取毒害艾美球虫孢子化卵囊总RNA,采用SMART技术,在逆转录酶的作用下将总RNA反转录成第一链cDNA,经LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA).经蛋白酶K消化、Sfi I酶切,过CHROMA SPIN-400TM柱去除小于400 bp的片段,与?TriplEx2TM噬菌体载体连接,用Gigapack ⅢGoldTM载体蛋白包装,构建了cDNA噬菌体表达文库.经测定,原始文库容量为4.72×106pfu/mL,扩增后的文库容量为2.62×1010pfu/mL,重组率为97.5%,插入片段为500～1100 bp.证实,该文库质量良好,为毒害艾美球虫新基因的筛选、克隆及功能研究奠定了基础.     

硒和维生素E与柔嫩艾美球虫感染的关系

选择 1日龄蛋用公鸡 72只 ,随机分为 6组 ,每组 12只。第Ⅰ～Ⅳ组鸡从 1日龄起在日粮中分别添加维生素E 5 6 .3、5 7.4、5 9.6、6 1.8mg/kg和硒 0 .93、1.0 3、1.2 3、1.4 3mg/kg ,第Ⅴ组为感染无添加剂组 ,第Ⅵ组为不感染无添加剂组 ,饲喂基础日粮 (含维生素E 4 8mg/kg和硒 0 .6mg/kg) 。至 2 1日龄时 ,第Ⅰ～Ⅴ组鸡口服接种柔嫩艾美球虫孢子化卵囊 ,1× 10 5个 /只 ,接种后观察感染鸡的状况。结果 ,第Ⅰ～Ⅵ组鸡平均增重分别为 2 2 .0、2 3.8、35 .2、39.2、8.9和 4 7.5 g ;病变值为 2 8、2 4、2 4、2 5、30和 0 ;1g粪便的卵囊数分别为 0 .17× 10 6 、0 .12× 10 6 、0 .0 9× 10 6 、0 .11× 10 6 、0 .2 1× 10 6 和 0个。提示 ,在日粮中添加维生素E和硒能提高鸡体的免疫力 ,增强鸡对球虫的抵抗力。     

中药体外抗柔嫩艾美球虫的研究

根据中兽医学理论和鸡球虫病的特点选用中药组方,进行体外抗球虫试验.结果所用中药组方具有明显抑制未孢子化卵囊的孢子化过程,且对已孢子化卵囊具有杀灭作用.     

温度对鸡早熟艾美球虫孢子囊形成的影响

从混合鸡球虫卵囊中分离单卵囊,感染增殖后收获大量单一种类球虫卵囊,将卵囊分别置于10~36℃、38~39℃、40℃恒温箱内培养,研究了温度对鸡早熟艾美球虫孢子囊形成的影响。结果显示,10~36℃时,孢子囊形成时间随温度提高而提前,每小时孢子囊形成率和增长幅度也随温度的提高而上升。10℃时,77 h初次形成孢子囊,孢子囊形成率达19.047%,经98 h孢子囊形成率达92.360%;36℃时,5 h初次形成孢子囊,孢子囊形成率达26.471%,经8 h孢子囊形成率达94.180%;38~39℃时,孢子囊形成率达一定时就不再上升,且随温度提高孢子囊形成率反而下降。38℃时,最高孢子囊形成率为52.800%,39℃时最高孢子囊形成率为12.500%;40℃时,球虫卵囊不会形成孢子囊,39~40℃是球虫卵囊形成孢子囊的临界温度。将卵囊分别置于40~65℃恒温干燥箱内经0.5 h处理后又经25~30℃培养24 h的结果表明,卵囊经40~50℃处理后仍可形成孢子囊,而经55℃以上温度处理就被杀死,45~50℃是球虫卵囊的生死临界温度。     

感染堆形艾美球虫的鸡血清生化指标检测

将 3 6只 2 4日龄AA鸡分为 3组 ,Ⅰ组每只鸡感染堆形艾美球虫 (Eimeriaacervulina)孢子化卵囊 70万个 ,Ⅱ组每只鸡感染 2 0万个 ,Ⅲ组为不感染对照组。对 3组试验鸡分别在感染前和感染后 4d、7d采心血 ,分离血清后检测 10项生化指标。结果 ,血清葡萄糖含量和天冬氨酸氨基转移酶活性在感染前后没有显著差异 (P >0 .0 5 ) ;血清总蛋白、白蛋白、甘油三酯含量和酸性磷酸酶活性在 4d和 7d均显著下降 (P <0 .0 5 ) ,其中Ⅱ组鸡的甘油三酯含量在 4d所降的幅度显著大于Ⅰ组 (P <0 .0 5 ) ;球蛋白、尿酸含量和碱性磷酸酶活性在 4d都显著升高 (P <0 .0 5 ) ,7d时Ⅰ组鸡的碱性磷酸酶活性仍显著高于感染前测定值 (P <0 .0 5 ) ,而球蛋白和尿酸含量均出现回落 ;Ⅰ组鸡的胆碱酯酶活性在 7d显著升高 (P <0 .0 5 ) ,Ⅱ组的胆碱酯酶活性在 4d和 7d均显著升高 (P <0 .0 5 )。     

中药复方禽球灵抗鸡柔嫩艾美球虫的效果

采用人工感染发病方法 ,观察了中药复方禽球灵抗鸡柔嫩艾美球虫的效果。结果表明 ,10 g/kg禽球灵对柔嫩艾美球虫的感染有较好的预防效果。抗球虫指数 (ACI)达 15 1.4 8,血便分数较感染不给药组降低了 4 8.2 2 % ,料肉比较感染不给药组降低了 2 6 .2 9%。