伪狂犬病病毒主要毒力基因对其致细胞病变能力的影响

以伪狂犬病病毒(PRV)Fa株为对照,时PRV Fa株TK基因缺失株、PRV Fa株gI/gE双基因缺失株和PRV Fa株TK/gI/gE三基因缺失株进行了细胞培养特性的观察.包括对照毒株在内的4个毒株均按0.5 mL(1×10~6PFU)接种量分别感染IBRS-2、Marc-145、ST、Vero和MDBK等细胞系;选择在接种后第0、8、12、24、36和48 h观察感染细胞的形态学变化.结果显示,这4个毒株在这5种细胞上均能增殖并引起细胞病变,但PRV基因缺失株引起的病变程度均不及Fa株.表明,PRV的不同毒力基因对其致细胞病变能力不同.     

伪狂犬病病毒Min-A株糖蛋白gE基因真核表达质粒的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒 (PRV)Rice株的 gE基因序列设计了 1对引物 ,用PCR法特异性地扩增出了PRVMin A株的 gE基因 ,并克隆到 pUC19中 ,再与杆状病毒转座质粒pFastBac1连接得到 pFastBac gE ,pFastBac gE转化穿梭载体Bacmid ,得到了重组rBacmid gE表达载体     

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法.敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL.表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测.     

伪狂犬病病毒gE/gB PCR鉴别方法的建立及其应用

为了检测伪狂犬病病毒(PRV)潜伏感染及确定病毒潜伏的主要部位,建立了能鉴别PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株gE/gB的PCR诊断方法。结果表明,所建立的PCR 特异性强、敏感性高、稳定性好,能用于病毒潜伏感染的检测;同时还确定PRV潜伏感染的主要部位是三叉神经节、扁桃体、嗅球、脑干、脑桥和咽黏膜。     

伪狂犬病病毒Bartha K61株Us区缺失片段的鉴定

为利用PCR技术对伪狂犬病病毒(PRV)Bartha K61株Us区的具体缺失情况进行分析,根据已发表的PRV全基因组序列设计了4对引物,以PRV双城株基因组作为对照,对Us区进行扩增.对扩增片段的序列分析表明,Bartha K61株基因组的Us区缺失了3 489 bp,为第122560～126049位核苷酸,其间包括部分gI基因、全部的gE和Us9基因以及部分Us2基因.     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与PRV的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRV DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。     

猪源伪狂犬病病毒福建龙岩分离株的鉴定及其TK基因和gE基因的分子特征

从福建省某规模化猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织中分离到1株病毒,通过病理剖检、PCR鉴定、病毒分离培养等方法证实该病毒为伪狂犬病病毒(PRV)野毒株,并命名为Fujian-LY株。对其主要毒力基因TK和gE的分子特征和遗传进化关系进行分析,结果表明,Fujian-LY株TK基因与参考序列的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为98.5%~99.8%和98.1%~99.4%;gE基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97.6%~99.8%和95.5%~99.3%。氨基酸多序列比对发现,Fujian-LY株TK基因在2个位点发生了独特性的氨基酸突变,即第16位氨基酸由K→R和第129位氨基酸由S→G。其中,第16位氨基酸突变导致TK蛋白ATP结合结构域由-G**G*GK-转变为-G**G*GR-。gE氨基酸序列最具特征性的变化是第48位和第496位各有1个天冬氨酸(D)的插入,该插入特征为PRV变异毒株的重要标志。遗传进化树分析结果表明,Fujian-LY株与2012年以来国内不同省份分离的PRV变异株的亲缘关系较近,属于近年来流行的PRV变异毒株,而与PRV经典株的亲缘关系相对较远。     

伪狂犬病病毒Min-A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒 (PRV) gE基因的序列设计了 1对引物 ,对PRVMin A株进行了PCR扩增 ,扩增产物克隆于 pGEM TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序 ,证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明 ,目的片段包含 1个 174 0bp的开放性阅读框(ORF) ,编码由 5 79个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明 ,PRVMin A株与PRVEa株、SH株gE基因的核苷酸同源性分别为 99.2 %、98.7% ;推导氨基酸的同源性分别为 98.6 %、97.2 %。     

伪狂犬病病毒gB和gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

采用大肠杆菌表达系统表达获得了伪狂犬病病毒(PRV)超强毒株ZJ01的gB和gE重组蛋白,用其免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆和间接ELISA筛选,获得了4株能稳定分泌抗PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞培养上清的ELISA抗体效价在1∶1 600~1∶6 400之间,腹水抗体效价达1∶4×105;连续培养20代,抗体效价基本一致。抗gB单克隆抗体B1B6和B3D7属于IgG2b,抗gE单克隆抗体E1B11和E5C10属于IgG1,轻链均为κ型。Western-blot和IFA结果显示,4株单克隆抗体均能与PRV流行毒株ZJ01、HZ、SD、NJ、LA发生特异性反应,B1B6和B3D7还能与PRV gE基因缺失疫苗毒株Bartha-K61发生反应,但E1B11和E5C10不能与Bartha-K61发生反应。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。     

牛分枝杆菌ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中的融合表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得了ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6基因和CFP-10基因通过(Gly4Ser)3接头连接,得到了融合基因.将融合基因片段先克隆于pMDl8-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a(+)中,通过限制性内切酶消化、菌液PCR鉴定、序列分析证实得到含预期序列的重组质粒pET-ESAT-6-CFP-10;该质粒转化BL21(DE3);经IPTG诱导,表达出了40 ku的融合蛋白;用Ni螯合层析方法纯化该蛋白,经SDS-PAGE检测,出现了清晰的单一条带;Western-blotting试验结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.结果表明,ESAT-6基因和CFP-10基因在大肠杆菌中融合表达成功并具有良好的反应原性.     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子基因的融合表达

将O型口蹄疫病毒VP1基因和牛集落刺激因子(GMCSF)成熟肽基因共同克隆到原核表达载体pGEX6P1中,转化RS21后经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白BoGMCSF/VP1在大肠埃希氏菌RS21中的高效表达,表达产物经SDSPAGE和Westernblotting分析,重组的蛋白质分子质量约为66ku,与预期大小相符。表达蛋白占菌体总蛋白的30%,表达产物以包涵体形式存在;包涵体提取物经变性复性,用透析方法提纯,得到高纯度的表达蛋白。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

枯草芽孢杆菌pgsA与猪传染性胃肠炎病毒Sa融合基因的原核表达

为利用原核表达方法使猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)Sa蛋白表达在细菌的外表面,对克隆载体pMD18-T-pgsA进行KpnⅠ+BamHⅠ双酶切,将所得片段插入表达载体pET-32a(+)中,构建了重组质粒pET-pgsA,对克隆载体pMD18-T-Sa和重组质粒pET-pgsA分别进行BamHⅠ+HindⅢ双酶切,将Sa片段插入pET-pgsA中,构建重组质粒pET-pgsA-Sa。重组质粒pET-pgsA-Sa经PCR和序列鉴定为阳性后,转化入宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,在70ku处出现了与预期大小相符的目的条带。Western-blot试验证实,融合基因pgsA-Sa获得了正确表达,具有良好的反应原性。间接免疫荧光试验证实融合蛋白在大肠杆菌表面获得了表达。结果表明,成功实现了TGEV Sa蛋白在细菌外表面的正确表达,初步鉴定其具有良好的反应原性。本研究为跨膜表达体系的建立和新型口服基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

口蹄疫病毒3C基因与增强型绿色荧光蛋白基因的真核共表达

为验证siRNAs对口蹄疫病毒(FMDV)复制的抑制效果,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增Asia 1型口蹄疫病毒Jiangsu/China/2005株的3C基因,克隆入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pEGFP-N1中,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染PK-15细胞,检测EGFP的表达和3C基因转录水平。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与Jiangsu/China/2005株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内有EGFP表达,实时荧光定量PCR检测到细胞内有3C基因的转录。证实,成功构建了FMDV 3C基因与EGFP共表达质粒并在PK-15细胞中获得了表达。     

猪瘟病毒E2基因和牛疱疹病毒Ⅰ型UL49基因的共表达

为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响,构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3.1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3.1-E2-UL49。将pcDNA3.1-E2与pcDNA3.1-E2-UL49分别转染293 T细胞,间接免疫荧光试验结果显示,单独表达E2蛋白的细胞,其荧光主要固缩于核周,而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光;Western-blot分析结果显示,VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达,但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些(P<0.01),表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。     

轮状病毒VP4蛋白与热稳定肠毒素融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用DNA重组技术,将用PCR扩增来的 VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体 pBin438 中,成功构建了重组表达质粒 pTh-VP4-ST和 pB-VP4-ST。将pTh-VP4-ST进行SDS-AGE分析,结果表明,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,大小约 40ku;同时将pB-VP4-ST转化了农杆菌EHA105。     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因与鸡白细胞介素2基因串联子在大肠杆菌中的共表达

运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒霉形体H3株TM-1基因进行串联,插入到pET-30a( )质粒的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点间,经PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,表明已成功构建了含鸡毒霉形体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因,将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a( )-TM-1-IL-2。将此重组质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株。经IPTG 37℃诱导表达4 h后,SDS-PAGE电泳结果显示,此融合基因得到了表达,所表达出的融合蛋白的分子质量约为43 ku,主要以包涵体形式存在。表达产物在尿素存在下经超声波处理,获得了纯化的融合蛋白。这为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒霉形体的生物学活性奠定了基础。