氟苯尼考混悬乳注射液对人工感染胸膜肺炎仔猪的药效学研究

为观察氟苯尼考混悬乳注射液对人工感染胸膜肺炎仔猪的疗效,选用体重8～10kg的杜×长×大三元杂交猪60头,分成6组,每组10头。除健康对照组之外,其他各组猪均滴鼻接种传染性胸膜肺炎放线杆菌菌液(1×109CFU/mL)5mL。人工接种后,用氟苯尼考混悬乳注射液肌肉注射治疗,观察并记录接种后各组猪临床表现,连续观察15d。对死亡猪剖检并取肺、肝涂TSA平板培养,检查是否有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,同时用标准血清进行血清学鉴定。试验结束后对存活猪称重,计算增重率。结果表明,肌肉注射20mg/kg剂量氟苯尼考混悬乳注射液,3d1次,连用2次,对治疗猪传染性胸膜肺炎具有显著的疗效。     

贵州某猪场胸膜肺炎放线杆菌血清5型的分离鉴定

2020年11月贵州毕节某猪场一头经产母猪突然发病死亡,为鉴定导致其发病死亡的致病菌,试验无菌采取病死猪病变肺组织,通过细菌分离培养、染色镜检、生化试验、16S rRNA PCR扩增等方法进行鉴定,并对分离菌进行药敏试验、血清型鉴定、毒素基因鉴定、耐药基因检测及毒力试验。结果显示,从病变肺中分离到1株病原菌,分离菌的菌落形态、菌体形态、生化特征和16S rRNA基因序列均与胸膜肺炎放线杆菌相符,将其命名为APP GZBJ2020;药敏试验显示,APP GZBJ2020株对头孢曲松、头孢哌酮、青霉素等9种药物敏感,对头孢氨苄和米诺环素中度敏感,对庆大霉素、红霉素、新霉素等9种药物耐药;血清型鉴定结果显示其为血清5型胸膜肺炎放线杆菌;毒素鉴定结果显示APP GZBJ2020株含有ApxⅠ、ApxⅡ及ApxⅣ三种毒素基因;耐药基因检测结果显示,APP GZBJ2020株携带有tem、gyrB、parC和parE四种耐药基因;动物毒力试验结果显示,APP GZBJ2020株对小鼠有致病性。试验成功从病死经产母猪病变肺中分离到1株血清5型胸膜肺炎放线杆菌,试验结果可为该猪场治疗发病猪提供一定帮助,并为了解胸膜肺炎放线杆菌在贵州省的流行血清型提供数据支持。     

猪胸膜肺炎放线杆菌分裂体形成相关基因的分析

猪胸膜肺炎放线杆菌细胞分裂的形态利用扫描电镜进行观察。根据文献报道收集细菌细胞分裂体形成的相关基因信息;应用BLAST、Smart和Pfam软件和GenBank中的有关序列,分析参与猪胸膜肺炎放线杆菌分裂体形成相关基因;根据GenBank中已报道的DNA序列设计Fts基因家族基因的引物,以App血清1型基因组为模板经PCR扩增有关基因片段并测序,再通过序列比对进行同源性分析。结果,猪胸膜肺炎放线杆菌细胞分裂主要发生在细胞中部,参与分裂体形成的相关基因有24种,其中Fts家族基因包括FtsZ,FtsB、FtsL、FtsH、FtsW、ZipA、FtsE、FtsX、FtsQ和FtsA共10种,这些基因在不同的血清型有很高的同源性。但未发现与FtsZ聚合相关的MinC、MinD和MinE。结果表明,猪胸膜肺炎放线杆菌的细胞分裂主要发生在细胞中部,分裂体形成机制与其他细菌存在差异。     

猪胸膜肺炎嗜血杆菌血清Ⅰ型菌溶血素的生产条件

猪胸膜肺炎嗜血杆菌(H.pleuropneumon-iae)又叫猪胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropne-umoniae)是引起猪的传染性胸膜肺炎的病原,各种年龄的猪均可感染,尤以3月龄仔猪受害最为严重,已成为各国集约化养猪场的主要危害之一。据报道,该菌有12个血清型,而以血清Ⅰ型菌毒力最强。当前预防本病尚无有效的方法,有人用灭活的猪胸膜肺炎嗜血杆菌溶血素预防本病,取得较佳效果。为提高本菌溶血素的产量,本试验对猪胸膜肺炎嗜血杆菌血清Ⅰ型菌溶血素的生产条件进行了如下探索。 (一)材料和方法     

胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株体内外培养转录差异的研究

为揭示胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株在体内外培养转录的差异,将该菌培养至对数期采用滴鼻的方式攻毒SPF级昆明小鼠,取小鼠肺组织及菌体纯培养物采用Illumina Hi Seq2500高通量测序平台对该菌在体内外培养的转录差异进行转录组测序(RNA-Seq)分析。结果显示,小鼠肺组织中获取该菌的Clean reads与指定参考基因组的比对效率达15.68%,体外培养菌体的比对效率为97.99%;以后者转录组为对照,共筛选出差异表达基因(DEG)333个,其中上调基因113个,下调基因220个,挖掘新基因6个。对DEG进行GO、COG及KEGG等分析可见,DEG主要富集在能量的产生与转化、碳水化合物转运和代谢、无机离子转运与代谢、氨基酸转运与代谢等方面,主要集中在碳代谢、ATP结合蛋白转运蛋白、嘌呤代谢、氨基酸的生物合成、硫代谢等通路上。本研究对胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株在SPF昆明小鼠体内及体外培养转录差异进行了分析,一定程度上揭示了该菌的致病机制,为后续胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株致病机制的研究提供了依据。     

胸膜肺炎放线杆菌抗体ApxⅣ-Dot-PPA-ELISA检测方法的建立

本研究构建了胸膜肺炎放线杆菌溶血外毒素ⅣA(ApxⅣA)的原核表达质粒pET-28a(+)-ApxⅣ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为48ku的ApxⅣ蛋白,经Western-blot分析表明该重组ApxⅣ蛋白具有反应原性。试验进一步用纯化的重组ApxⅣ蛋白作为抗原,建立了胸膜肺炎放线杆菌抗体的Dot-PPA-ELISA检测方法,该方法诊断膜片上点样ApxⅣ抗原质量为0.737μg,该方法检测灵敏度高,可检测到胸膜肺炎放线杆菌标准阳性血清IgG的最低含量为8.374×10-9 g;检测特异性好,不与副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪链球菌2型、多杀性巴氏杆菌、日本脑炎病毒的阳性血清发生交叉反应。应用建立的诊断方法对446份临床血清样品进行检测,胸膜肺炎放线杆菌抗体的阳性检出率为25.37%。结果表明,该方法具有操作方便、灵敏、结果易于判读等优点,可应用于猪场猪传染性胸膜肺炎的血清学诊断。     

胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌株体外培养PalA基因表达规律的研究

为了解对机体免疫反应具有副作用的肽聚糖相关脂蛋白在胸膜肺炎放线杆菌(APP)体外培养中的表达规律,建立了一种SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法,对PalA基因在APP血清7型菌株体外培养不同生长阶段的表达情况进行了监测,并对比分析了菌株生长曲线与该基因的表达曲线。结果显示,成功建立了实时荧光定量PCR标准曲线y=-3.578x+48.982(E=90.3%,R~2=0.999),最低检测浓度为1.1×10~2copies/L,并具有较好的特异性与重复性。菌液生长到第6小时(D_(600)=0.834)进入稳定期,活菌含量最高,达2.38×109CFU/m L,此时PalA基因的表达量较低,为0.609 ng/L,约占总反转录cDNA的0.366‰。菌液生长至第8小时(D_(600)=0.835)达到PalA基因表达最高峰,为0.913 ng/L,约占总反转录cDNA的0.564‰。菌液生长到第6小时满足菌液活性大、活菌含量高且PalA蛋白含量低等特点。本试验为临床APP全菌疫苗的生产提供了一定借鉴。     

鉴别猪胸膜肺炎放线杆菌2/6/8/12型的多重PCR方法的建立

为快速准确鉴别猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清2、6、8、12型,从已发表的文献中筛选出4对引物,通过扩增体系和扩增程序的优化来建立APP血清2、6、8、12型的多重PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果发现,所建立的多重PCR方法特异性良好,对APP血清1～15型进行PCR检测,除血清2、6、8、12型外,均不能扩增出任何条带,检测猪链球菌、副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌和猪大肠杆菌也呈阴性,对APP血清2、6、8、12型的细菌纯培养物、组织样品的检测敏感性分别都为1×10~3CFU/mL、1×10~3CFU/g。本PCR方法快速有效,可在4.5 h左右直接从肺脏组织中得到检测结果。本方法的建立为APP的分子分型和流行病学调查提供了有力的技术支撑。     

胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定及免疫预防

从陕西省某猪场分离到 1株细菌 ,经培养特性、形态观察及生化试验等鉴定为胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacilluspleuropneumoniae) ;动物致病性试验对豚鼠、小白鼠有很强的致病性 ;该菌对羧苄青霉素、氯霉素等高度敏感 ,对氟哌酸、复合磺胺等有耐药性。分离菌制成油佐剂灭活苗 ,对猪进行一免后 3 0d抗体凝集效价可达 1∶3 2 ,二免后 3 0d抗体凝集效价可达 1∶12 8以上     

抗菌肽HJH-1对猪胸膜肺炎放线杆菌形成生物被膜的影响

细菌的生物被膜是病原微生物产生耐药性、免疫逃逸和造成持续感染的重要因素之一。为了解抗菌肽HJH-1对猪胸膜肺炎放线杆菌形成生物被膜的影响,本研究采用微量测定法结合扫描电子显微镜技术来评价HJH-1对APP生物被膜的作用。结果显示,与对照组相比,添加浓度为100 g/m L的抗菌肽HJH-1后,在培养APP至第48小时形成的生物被膜的数量显著减少,说明HJH-1能显著抑制APP的生长(P0.05);扫描电子显微镜的检测结果也显示,HJH-1在50 g/m L时APP形成的生物被膜变薄,细菌的间隙增大,HJH-1在100 g/m L时可明显抑制APP形成生物被膜;小鼠肺炎模型研究结果也发现,皮下注射HJH-1(20 mg/kg)可以有效减轻APP所引起的肺部炎症性反应。本研究结果为猪胸膜肺炎放线杆菌的治疗提供新的思路,也为抗菌肽HJH-1的临床应用提供了理论基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

胸膜肺炎放线杆菌感染对猪肺及肺门淋巴结抗氧化功能的影响

将24头健康DLY(杜洛克×长白×约克夏)仔猪按性别、体重随机分为2组,采用鼻腔喷雾法分别接种生理盐水(对照组)和含3.8×107 CFU/mL胸膜肺炎放线杆菌的稀释液(试验组),研究了猪感染胸膜肺炎放线杆菌48h后血清及肺组织抗氧化功能的变化。结果显示,试验组血清中SOD、CAT的含量极显著低于对照组(P<0.01);GSH-Px、MDA含量极显著高于对照组(P<0.01);-OH含量显著高于对照组(0.010.05)。试验组肺组织除CAT含量显著高于对照组(0.01相似文献   

肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据肺炎克雷伯菌16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的检测,建立了肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR。结果显示,该方法与猪肺炎支原体、猪鼻支原体、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌、肠球菌、乳杆菌、解淀粉芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共15种细菌无交叉反应;标准品浓度在2.29×109~2.29×104 copies/μL范围内具有良好的线性关系,最低可检测到2.29×102 copies/μL的标准品阳性质粒;批内和批间变异系数均小于3%。临床样品的检测结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和检测快速的优点,可用于肺炎克雷伯菌感染的早期诊断、样品的快速检测以及肺炎克雷伯菌的定量分析。     

胸膜肺炎放线杆菌体内表达基因的筛选

利用体内诱导抗原技术对胸膜肺炎放线杆菌(APP)体内表达的基因进行了初步筛选.将收集到的5份感染了APP1型的猪血清混合,分别用体外培养的APP1和大肠杆菌BL21(DE3)的全菌及全菌裂解物进行吸附,用ELISA方法检测吸附效果,经吸附后血清D450nm分别由原来的0.927和0.239降低为0.196和0.078.同时,将APP1基因组DNA以Bsp143 Ⅰ进行酶切,回收500～2000 bp的片段,与pET30a/b/c载体连接,构建了APP1基因组质粒表达文库,库容量(CFU)为2.0×105.用吸附后的血清通过菌落原位免疫杂交筛选该基因组表达文库,从3 000个菌落中获得了12个阳性克隆.     

猪四种呼吸道病原菌四重PCR检测方法的建立与应用

为建立可同时快速检测猪支气管败血波氏杆菌(Bb)、副猪嗜血杆菌(Hps)、胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌(Pm)的四重PCR方法,根据Bb的fla基因、Hps的16S rRNA基因、App的apxⅣ基因和Pm的特异性基因KMT1设计4对特异性引物,基于TaKaRa公司的Premix Taq PCR预混酶,对四重PCR的引物浓度和退火温度进行优化,确定该四重PCR的反应体系和反应条件,通过对特异性及同一种病原菌不同血清型检测的通用性、敏感性和重复性评价,建立快速检测猪这4种呼吸道病原菌的四重PCR方法,同时应用该方法对81份临床样本进行检测,检测结果与这4种病原菌单项PCR检测以及4种病原菌的分离鉴定结果进行比较。结果表明,该方法能同时对这4种病原菌进行检测,特异性和通用性好、重复性好,对这4种病原菌DNA的最低检测质量浓度为20 pg/L,对这4种细菌的最低检出量分别为1×10~3CFU/mL的Pm,1×10~2CFU/mL的Hps、Bb和App,敏感性高。81份临床样本的四重PCR检测结果和单项PCR检测结果一致,PCR检出率明显高于细菌分离鉴定结果。本研究成功建立了可同时检出猪支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌的四重PCR方法,该方法可用于临床样本的快速检测以及这4种病原菌的鉴别检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌半套式PCR检测方法的建立及应用

根据1型胸膜肺炎放线杆菌apx Ⅳ A基因3'端序列设计3条引物,建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的半套式PCR方法.筛选了该方法的最佳反应条件,并采用该方法进行临诊检测,比较了不同处理临床样品的检测结果.结果表明,该方法能检测出所有供试血清型APP,不能从猪上呼吸道常见细菌基因组DNA中扩增出条带,特异性好;最低DNA检出量为16.5 fg,其灵敏性是常规PCR方法的1 000倍;重复性试验结果表明,该方法稳定可靠.应用半套式PCR方法检测临床样品,检出率显著高于细菌分离鉴定;样品保存方法和核酸抽提方法能影响阳性样品的检出率.     

副猪嗜血杆菌LAMP检测方法的建立

为建立快速鉴别检测副猪嗜血杆菌的方法,根据Gen Bank中公布的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因设计环介导等温扩增(LAMP)引物,利用Loopamp Realtime Turbidimeter LA-320c仪对反应体系和条件进行优化,建立了检测副猪嗜血杆菌的LAMP方法。结果显示,该方法可在65℃下反应15 min实现肉眼可视化直接判定结果。该方法仅对副猪嗜血杆菌有特异扩增,对胸膜肺炎放线杆菌、肠炎沙门菌等其他10种相关病原菌均无特异性扩增,表明特异性好,且具有较好的重复性及稳定性。其检测的灵敏度为0.175 fg/L,高于PCR方法1×10~4倍。对94份临床发病猪的鼻拭子样品平行检测结果显示,LAMP方法与NY/T 2417—2013标准中的方法间的符合率为96.8%。本方法为基层和口岸快速鉴别诊断副猪嗜血杆菌病提供了新的技术手段。     

鸭疫里氏杆菌平板凝集抗原的制备

为了对鸭传染性浆膜炎进行快速的型别诊断,探索了不同灭活方法、菌液浓度、染色方法和保存条件对标准1型和2型鸭疫里氏杆菌凝集抗原的影响。结果显示,用甲醛溶液灭活细菌制备的抗原比加热灭活的灵敏度高;石炭酸复红染色液的染色效果优于虎红染色液和草酸铵结晶紫染色液;经石炭酸复红染色液染色的菌液浓度达到109数量级时,常温和4℃保存1年稳定性良好。结果表明,制备的鸭疫里氏杆菌平板凝集抗原可用于临床鸭疫里氏杆菌感染或免疫后抗体的检测。     

水貂A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及免疫原性研究

从送检的疑似多杀性巴氏杆菌感染的水貂中分离到1株病原菌,经培养特性、形态观察、生化试验、PCR鉴定等,确定RC1108菌株为血清A型多杀性巴氏杆菌。水貂回归试验表明,该菌株毒力较强,最小致死剂量为2.5×10~8CFU。制备的灭活疫苗在含菌量为1.5×10~9 CFU/m L时,即可在免疫后第21天提供保护。表明,该分离菌株可以作为水貂血清A型多杀性巴氏杆菌疫苗的候选株。     

菌威克对鸡大肠杆菌病的预防和治疗试验

用硫酸庆大霉素和硫酸黏杆菌素混合制剂菌威克对试验性鸡大肠杆菌病进行了预防与治疗试验。硫酸庆大霉素和硫酸黏杆菌素对鸡大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度分别为 7.5× 10 - 4mg/L和 5 .9× 10 - 5mg/L ,最小杀菌浓度分别为 1.5× 10 - 3mg/L和 1.2× 10 - 4mg/L。在成本相近的情况下 ,以杀菌效果最佳比例配制的菌威克制剂的疗效要高于单独使用任何一种药物。预防与治疗试验结果表明 ,大剂量与中剂量菌威克对鸡大肠杆菌病的预防与治疗效果高于低剂量菌威克与单独应用硫酸庆大霉素和硫酸黏杆菌素的效果 (P <0 .0 5 )。