ERK信号转导通路对家兔脑炎原虫性脑肉芽肿形成的影响

为了探讨ERK信号转导通路对脑炎原虫性脑肉芽肿形成的影响,应用普通染色、特殊染色、免疫组织化学技术和Western-blot技术分别对脑炎原虫性脑肉芽肿进行观察,分析脑炎原虫性脑肉芽肿形成与信号转导通路中神经生长因子(NGF)、酪氨酸蛋白激酶(TPK)、丝裂源活化蛋白激酶(MAPK)和细胞外信号调节激酶(ERK)等四种关键性蛋白的关系。结果显示,所有患病家兔的脑组织中均有数量不等的脑肉芽肿和非化脓性脑炎变化;免疫组化染色显示,NGF、TPK、MAPK和ERK的表达在肉芽肿中的星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞中明显增高,呈强阳性反应,染成深棕色;用Western-blot检测,患病家兔脑组织中的NGF、TPK、MAPK和ERK等信号转导通路关键蛋白表丰度明显高于健康家兔。以上结果表明,ERK信号转导通路通过强大的级联反应参与了家兔脑炎原虫性脑肉芽肿的形成,在脑肉芽肿形成过程中促进星形胶质细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞增殖。     

兔脑炎原虫引起脑星形胶质细胞增殖和胶质纤维酸性蛋白的表达

为了研究兔脑炎原虫引起脑组织星形胶质细胞增生的特点和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的丰度,经特殊染色、免疫组织化学染色和免疫印迹技术对30只病兔和10只对照兔的脑组织进行了详细的研究。结果显示,病兔的脑组织出现了弥漫性或局灶性非化脓性脑炎病变及不同形态的特异性肉芽肿。用改良的革兰染色可在肉芽肿的上皮样细胞及坏死组织中检出蓝色的兔脑炎原虫;用甲基绿派若宁染色可在上皮样细胞的胞质中检出红色的兔脑炎原虫;用抗-GFAP免疫组织化学染色,见病兔脑组织中有大量星形胶质细胞增生,在脑肉芽肿及血管套周围也有大量反应态星形胶质细胞,使之与正常脑组织隔离,增生的星形胶质细胞的足突在血管周围、脑软膜下和室管膜细胞的基底部形成厚层屏障膜。用免疫印迹技术检测,病兔脑组织中GFAP表达的丰度明显高于对照兔,且与抗-GFAP免疫组织化学染色的结果相一致。研究结果表明,兔脑炎原虫能引起脑组织中星形胶质细胞增生,反应态的星形胶质细胞形成的各种屏障膜可保护脑组织免受更大的损伤。     

17β-雌二醇对海马组织结构和GFAP表达的影响

为研究17β-雌二醇对脑的保护作用机制,以去卵巢大鼠为动物模型,采用甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和透射电镜技术,观察了17β-雌二醇对海马组织结构和胶质纤维酸性蛋白表达的影响。结果显示:①与对照组、假手术组和去卵巢后补充雌激素组比较,在去卵巢组中,海马CA1～3区、齿状回神经元数量显著减少(P<0.05),CA4区神经元数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量增加不显著(P>0.05);海马CA1～4区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达增加,除CA4区与去卵巢后补充雌激素组之间无显著差异外(P>0.05),其余均差异显著(P<0.05);海马CA1区神经元、胶质细胞线粒体肿胀,神经元突触和突触囊泡减少,轴突变性;②与去卵巢组比较,去卵巢后补充雌激素组海马CA1～3区、齿状回神经元数量明显增加(P<0.05);海马CA1～4区、齿状回星形胶质细胞数量减少不显著(P>0.05);海马CA1～3区、齿状回胶质纤维酸性蛋白表达显著降低(P<0.05);保持了海马CA1区神经元和胶质细胞超微结构的正常。结果表明,17β-雌二醇能通过增加神经元数量,降低星形胶质细胞胶质纤维酸性蛋白表达,保持神经元和胶质细胞正常的超微结构,实现对海马的保护。     

γ-干扰素调节猪耳廓血管微循环作用机制的iTRAQ技术分析

应用蛋白质组学技术(i TRAQ)分析仔猪耳廓血液γ-干扰素(IFN-γ)变化过程中的差异表达蛋白,探讨IFN-γ在耳廓微循环中的机制和作用。通过3次生物学重复试验,共鉴定出224种显著差异表达蛋白质,与对照组相比,其中122种蛋白的表达量上调,102种蛋白的表达量下调。生物信息学分析提示这些蛋白主要参与脱氧核糖核酸酶活性调控、血小板激活和聚集等过程。代谢通路分析显示,这些蛋白主要参与核糖体、剪切体和内质网蛋白等多种信号通路,涉及调控细胞骨架、细胞黏附性及细胞因子转录等多种生理活动,初步鉴定核因子κB在IFN-γ的调控中发挥了重要的作用。用生物高通量技术检测了IFN-γ注射后差异表达蛋白质在仔猪耳廓微循环中的表达,为疾病监控和治疗提供新型的生物标志物和靶向药物作用位点奠定了基础。     

犬眼睑鳞状上皮细胞癌的组织病理学诊断

对一例自然患病犬眼睑增生组织进行组织病理学观察,以确定增生组织的病理学类型。对病犬进行血常规及生化检查,取手术切除增生组织标本,经福尔马林溶液固定后,进行常规石蜡包埋、切片、HE染色、SABC法免疫组织化学试验,并利用NIS-Elements高清晰度彩色图文分析系统记录观察结果。结果显示,血常规及生化检查白细胞浓度偏高;HE染色镜检,可在增生组织内见到明显的角化珠和细胞间桥。免疫组织化学检测结果显示,细胞角蛋白、上皮膜抗原、S-100蛋白均为阳性。结果表明,该眼睑增生组织为鳞状上皮细胞癌。     

犬五种典型肿瘤的病理学诊断

本研究分别对5例犬类恶性肿瘤进行病理学分析。通过石蜡切片的HE染色及免疫组织化学方法进行病理学诊断及分析。疑似甲状腺癌病犬的病理组织学观察发现甲状腺癌细胞的体积比正常细胞大,存在包膜和血管侵犯。免疫组织化学结果显示TG、Galectin-3阳性,而CT呈免疫阴性,判定肿瘤内甲状腺滤泡癌;疑似恶性神经鞘瘤病犬的病理组织学观察神经组织可见波浪状,梭形细胞界限不清浅染,核细长间深染。免疫组织化学结果显示S-100、波形蛋白、GFAP、NSE和巢蛋白呈较强阳性表达,确诊为恶性外周性神经鞘瘤;疑似脑膜瘤病犬的病理组织学观察发现,脑膜瘤右叶硬膜下增厚,出现巨细胞,核异形、深染,发现小型结节有钙化斑,PSA染色阳性。免疫组织化学结果显示Vim呈较弱阳性表达,S-100呈阳性表达,结蛋白阴性,最后确诊为脑膜瘤(颗粒细胞型);疑似甲状腺癌病犬的病理组织学观察发现甲苯胺蓝染色后呈阴性且CD117、HLA-DR呈阳性表达,初步诊断为造血细胞源性恶性肿瘤;疑似肾母细胞瘤病犬的病理组织学观察发现肺转移组织发现类似胚胎肾小球、肾小管组织。GFAP、NF阴性表达,CD10、CK、Vim和SMA为阳性表达,确诊为肾母细胞瘤。     

家兔γ干扰素基因的原核表达及其表达产物的单克隆抗体的制备

将PCR扩增的家兔γ干扰素基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体上,构建重组载体pET-28a(+)-IFN-γ。重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导、HisTrap亲和柱纯化,获得IFN-γ重组蛋白。以IFN-γ重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞技术获得4株抗IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为3H8、4G4、4F10、6C12,它们的亚型分别为IgG1、κ链,IgG2b、κ链,IgG1、κ链,IgG1、κ链。分别制备单克隆抗体腹水,结果,4株单克隆抗体腹水的间接ELISA效价在10-4~10-5之间。本试验通过制备抗家兔IFN-γ单克隆抗体,为研究和检测IFN-γ提供了一种重要的工具。     

大片吸虫Ras家族蛋白基因的克隆表达及免疫反应性研究

Ras家族相关蛋白是多种信号转导途径的关键组成蛋白,在寄生虫的生长发育过程中发挥着重要作用,但大片吸虫的Ras家族蛋白基因(Fg Rap1)尚未见报道。本研究旨在对Fg Rap1进行克隆、表达、序列分析及免疫反应性评价。根据肝片吸虫的基因组及转录组数据,设计肝片吸虫Ras家族蛋白基因引物,以大片吸虫总RNA为模板,通过RT-PCR获得Fg Rap1基因;对其进行生物信息学分析及鉴定;然后构建p ET-SUMO-Fg Rap1重组表达载体,在大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明,大片吸虫Fg Rap1基因大小为648 bp,编码215个氨基酸残基。生物信息学分析表明,该蛋白含有9个亲水区,但无跨膜区,有6个α螺旋、8个β折叠、2个较长的β转角、1个较长的无规则卷曲和8个主要的线性B细胞抗原表位。Fg Rap1蛋白为包涵体表达,用大片吸虫排泄分泌抗原免疫家兔的阳性血清进行Western-blot分析,表明其具有良好的免疫反应性。本研究首次克隆并鉴定了大片吸虫Ras家族蛋白基因,表达的重组蛋白具有良好的免疫反应性,该蛋白是潜在的大片吸虫诊断候选抗原。     

重组蛋白P60与LLO对单核细胞增多性李斯特菌灭活疫苗的免疫增强效果

为增强单核细胞增多性李斯特菌(简称单增李斯特菌)灭活疫苗的免疫效果,对单增李斯特菌入侵相关蛋白(P60)基因进行了克隆、表达及纯化,分别与低剂量李斯特菌溶血素O(LLO)、单增李斯特菌灭活菌混合,以MontanideISA206为佐剂制成疫苗,皮下接种家兔,并设灭活疫苗免疫组和PBS对照组,定期检测3组家兔的血清抗体、IL-4和IFN-γ水平的变化;二免后第21d每只家兔腹腔注射2×108CFU单增李斯特活菌攻毒,观察各组家兔的发病情况,每隔24h检测一次细菌在各组家兔体内的繁殖率。结果表明,添加P60和低剂量LLO重组蛋白的单增李斯特菌灭活疫苗免疫组家兔二免后抗体水平明显高于其他各组,且能诱导Th细胞向Th1型分化,抑制Th2型细胞的分化,调节抗原特异性免疫应答,能有效抵抗单增李斯特菌的感染,使细菌在家兔体内(外周血、脾)的几何增长率从64.69%降到24.06%,免疫效果明显优于灭活疫苗单独免疫组。证明P60和低剂量LLO能增强灭活疫苗的免疫保护效果。     

热应激对猪睾丸Spo11表达与定位及其诱导DNA双链断裂的影响

为探究热应激对猪睾丸Spo11、DNA双链断裂分子标记γH2AX和DNA重组修复分子标记Rad51表达和定位的影响,笔者构建了环境热应激（37℃环境温度,每日加热3 h,连续7 d）和睾丸局部热应激（42℃,局部阴囊加热1 h）的猪动物模型,未处理组猪睾丸作为对照。通过免疫组织化学染色、Western-blot和qRT-PCR等方法检测Spo11、Rad51和γH2AX在猪睾丸中的表达和定位。免疫组化结果显示,对照组生精小管内可见各级生精细胞,Spo11和Rad51主要定位于初级精母细胞的细胞核,γH2AX免疫阳性染色见于初级精母细胞的细胞核。与对照组相比,环境热应激组初级精母细胞的细胞核Spo11和γH2AX免疫阳性着色无明显差异,Rad51免疫阳性着色较弱;局部热应激组初级精母细胞的细胞核Spo11、Rad51和γH2AX免疫阳性着色较强,细胞定位未发生变化。Western-blot和qRT-PCR结果显示,与对照组相比,环境热应激组Spo11蛋白、m RNA和γH2AX蛋白水平均无显著差异,Rad51蛋白和m RNA表达水平均显著降低（P<0.01）;局部热应激组Spo11...     

猪流行性腹泻病毒nsp1蛋白对IFN-β激活的JAK/STAT信号通路的影响

为探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)非结构蛋白nsp1对干扰素(IFN)激活的Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)信号通路的影响,将PEDV nsp1蛋白表达质粒转染HeLa细胞,并用IFN-β处理,应用Western-blot对STAT1、STAT2磷酸化以及早幼粒细胞白血病蛋白(PML)表达水平进行检测,应用IFA试验对STAT1、STAT2核移位以及PML蛋白表达水平进行检测,应用双荧光素酶分析系统对干扰素刺激反应元件(ISRE)-Luc进行检测,应用荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)对IFN刺激基因15(ISG15)、ISG56以及PML转录水平进行检测。结果显示,nsp1蛋白过表达细胞内STAT1和STAT2的蛋白表达水平、磷酸化作用以及磷酸化STAT1(pSTAT1)、pSTAT2的核移位不受影响,而ISRE启动子的表达水平受到显著抑制,ISG15、ISG56转录水平显著下调,PML转录水平和蛋白表达水平显著降低。结果表明,PEDV nsp1蛋白可以抑制IFN-β激活的JAK/STAT信号通路。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡IL-18成熟蛋白基因在杆状病毒表达系统中的双表达

为了研制针对传染性法氏囊病病毒(IBDV)的新型疫苗,将IBDV的VP2基因和鸡IL-18成熟蛋白(mChIL-18)基因分别插入到双表达载体pFastBacDual的启动子P10和PH的下游,构建重组转移质粒pFastBacDual-VP2-IL-18。将其转座入大肠杆菌DH10Bac,获得了重组杆状病毒质粒,然后在昆虫细胞Sf9中双表达VP2-IL-18蛋白,并对双表达的VP2-IL-18进行生物学活性测定。结果显示,同一细胞中能分别表达出VP2蛋白和鸡IL-18蛋白,且表达的蛋白位于细胞胞质内。当VP2-IL-18的质量浓度为200ng/mL时能刺激鸡脾淋巴细胞产生IFN-γ,IFN-γ的活性最高可达2.8×104 U/mL。当VP2-IL-18诱导产生的IFN-γ的浓度≥10U/mL时就能产生抑制水泡性口炎病毒的效果。结果表明,双表达蛋白VP2-IL-18可以产生较强的生物学活性,为研制新型传染性法氏囊病IBD疫苗奠定了基础。     

TLR4/MyD88通路在油酸促进BRL 3A细胞脂肪变性中的作用

为研究TLR4通路在油酸(oleic acid,OA)致BRL 3A细胞脂肪变性中的作用,用不同浓度的OA(0、1.2、1.8、2.4 mmol/L)处理BRL 3A细胞24 h,再用显微镜观察细胞损伤状况,DAPI染色观察细胞核形态,油红O染色观察脂滴生成量,甘油三脂(TG)试剂盒测定TG含量,Western-blot检测TLR4通路蛋白TLR4、My D88、TBK1的表达量。结果显示:与对照组相比,随着OA浓度增加,细胞损伤增加,细胞核变形、破碎、皱缩,呈一定的浓度梯度依赖性;细胞内脂滴生成量增加,TG含量显著增加(P0.05);与对照组相比,TLR4、My D88及TBK1的表达量随着OA浓度增加呈显著或极显著增加(P0.05或P0.01)。这表明油酸可能通过TLR4/My D88途径促进BRL 3A细胞发生脂肪变性。     

周围神经浸出液对犬脂肪干细胞向神经膜细胞分化的影响

本研究旨在研究周围神经浸出液对犬脂肪源性干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)向神经膜细胞(Schwann cell,SCs)分化的影响。采用Ⅰ型胶原酶消化法体外原代培养犬ADSCs,并应用流式细胞术进行表型分析,同时观察所培养细胞的成脂成骨分化能力。分离犬坐骨神经,无菌剪碎、浸出和过滤制备犬周围神经浸出液。将周围神经浸出液作为诱导剂,作用于犬ADSCs,7d后分别通过倒置显微镜观察细胞形态的变化;免疫荧光试验和Western-blot观察SCs标志蛋白GFAP和S-100的表达情况。结果显示,周围神经浸出液作用于犬ADSCs 7d后,大多数细胞形态由原来的三角形或梭形变为两端伸出2个细长突起的长梭形,非常像成熟SCs的形态;免疫荧光和Western-blot试验显示,周围神经浸出液诱导ADSCs后,细胞出现GFAP和S-100阳性表达。以上结果提示,周围神经浸出液能有效诱导犬ADSCs向SCs分化。     

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理,采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51-17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pm9616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因,并对其进行序列分析。将C51-17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中,将重组表达载体pET30a-prfA转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95.6%~100%,在氨基酸水平上的同源性为98.9%~100%。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45.6ku,与预期的大小一致,以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应,具有良好的反应原性。     

表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答

为研究猪流行性腹泻病毒中和抗原位点(COE)基因在乳酸菌中的表达情况,进而探讨重组乳酸菌的免疫原性。将COE基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG-1中,构建重组表达载体pPG-1-COE,并将其电转化入干酪乳杆菌Lactobacilluscasei393中,应用Western-blotting、间接免疫荧光染色和全细胞ELISA检测重组蛋白的表达情况,用重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠,测定免疫应答水平。结果表明,COE可在构建的重组干酪乳杆菌表达系统中表达,目的蛋白定位于细胞表面。在免疫组小鼠血清、粪便中检测到较高水平的特异性IgG、sIgA(P0.01);血清具有中和活性(1∶12);脾淋巴细胞增殖指数明显高于对照组,IL-4和IFN-γ水平显著提高(P0.01)。证实,该重组干酪乳杆菌表达系统可诱导小鼠产生对猪流行性腹泻病毒特异的黏膜免疫应答和系统免疫应答。     

玉米赤霉烯酮致大鼠睾丸支持细胞DNA损伤的研究

以大鼠原代睾丸支持细胞为材料,用0(对照组)、5、10、20 mol/L的玉米赤霉烯酮(ZEA)进行染毒,24 h后,通过彗星试验观、免疫荧光试验、Western-blot等方法检测ZEA对细胞DNA及相关蛋白表达的影响。结果显示,随着ZEA浓度的增加,DNA彗星样拖尾现象逐渐明显,与对照组比较,10 mol/L和20 mol/L ZEA剂量组的细胞的彗星拖尾尾长、尾部DNA含量比例和尾矩均有极显著差异(P0.01);10 mol/L和20mol/L ZEA剂量组γ-H2AX焦点数量均较对照组有极显著差异(P0.01);各染毒组γ-H2AX、P53、P21等蛋白的表达水平均较对照组有显著或极显著差异(P0.05或P0.01)。结果表明,ZEA能致大鼠睾丸支持细胞DNA损伤,这一过程能激活P-ATM→P53→P21信号通路,促使细胞发生生长阻滞并抑制其增殖。     

FSH对仔猪睾丸支持细胞增殖和GDNF表达的调节

以原代培养的仔猪睾丸支持细胞(SC)为试验模型,研究了FSH对SC胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达及其增殖的影响。结果显示,外源性添加FSH可促进GDNF蛋白表达,而且这种促进作用具有浓度和时间依赖关系,GDNF蛋白水平随着FSH浓度的增加而升高,当FSH浓度为50 ng/mL时,GDNF水平达到最高,然后逐渐降低;FSH(50 ng/mL)作用30 min,可显著促进GDNF蛋白的表达(P<0.05),当FSH作用1 h时,GDNF蛋白水平达到最高,随后逐渐降低。FSH可以时间-剂量依赖性促进SC增殖细胞核抗原(PCNA)的表达,FSH(50 ng/mL)作用30 min时,PCNA的表达显著增加(P<0.05),作用1 h达极显著水平(P<0.01),至2 h时,PCNA蛋白的表达水平达到最高,随后逐渐降低。提示,FSH可在体外条件下通过刺激SC表达GDNF进而促进其增殖。     

斑点叉尾鮰维氏气单胞菌病的病理组织学观察

应用无菌操作技术,从患病的斑点叉尾鮰肝、肾中分离病原菌,并进行生理、生化鉴定。同时通过病理切片和HE染色技术,观察由维氏气单胞菌引起的自然发病斑点叉尾鮰的肝、肾、脾、肠、脑、鳃等器官的病理组织学变化。结果显示,从患病鱼的肝、肾中分离到形态、大小一致的细菌,经鉴定为维氏气单胞菌。镜下可见患病叉尾鮰肝细胞严重空泡变性,部分区域肝细胞坏死、溶解,相互融合成溶解性坏死灶;肾小球毛细血管严重充血,充满大量红细胞,肾小囊扩张,肾间质严重出血,拟淋巴细胞及造血组织减少,大量含铁血黄素及单核细胞、嗜中性粒细胞等炎性细胞浸润;脾出血,淋巴细胞减少,大量含铁血黄素及红细胞浸润;肠黏膜下层和浆膜层水肿,小血管和毛细血管充血;脑浆膜和基质水肿;鳃小片毛细血管严重充血,基部细胞增生,呼吸上皮浮离,有的呼吸上皮细胞和柱细胞变性、坏死,使部分鳃小片腐离脱落。表明,维氏气单胞菌可引起斑点叉尾鮰多器官组织,特别是肝、肾、脾、脑、鳃等重要功能器官出现典型的病理变化并引起死亡。     

BDNF和TrkB在幼犬生殖器官中的表达

为了探讨脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体酪氨酸蛋白激酶受体B(TrkB)蛋白在幼犬生殖器官中的表达情况,选取4只40日龄左右的幼犬分别进行手术采集卵巢、子宫、输卵管和睾丸样品,运用免疫组织化学方法分析BDNF和TrkB蛋白在这4种器官中的分布情况。结果表明,BDNF蛋白在卵泡细胞胞质中强表达,在初级卵母细胞中表达较弱,而TrkB仅在卵泡细胞中表达,此外,BDNF和TrkB都在卵巢间质细胞中表达。BDNF和TrkB在子宫内膜上皮和腺上皮以及输卵管黏膜上皮细胞中都有表达,TrkB在子宫和输卵管的固有层和肌层部分细胞中也可见表达。BDNF和TrkB都在睾丸的精原细胞中表达。结果提示,BDNF蛋白对幼犬生殖器官的活动有一定的调节作用,可能通过与其受体TrkB的特异性结合来实现其功能。