蓝舌病病毒和流行性出血病病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立检测蓝舌病病毒(BTV)和流行性出血病病毒(EHDV)的快速诊断方法,笔者根据BTV的第10基因节段(Seg-10)和EHDV的第5基因节段(Seg-5)序列,分别设计BTV与EHDV的特异性引物和TaqMan探针,经过反应条件优化,建立了同时检测两种病毒的双重荧光定量RT-PCR方法,并进行了特异性、灵敏度、重复性和临床样品检测验证。用该方法对BTV Seg-10和EHDV Seg-5节段的体外转录ssRNA为模板绘制标准曲线,相关系数(R~2)均大于0.995,线性关系较好;该方法可检测不同血清型的BTV和EHDV,与阿卡斑病病毒(AKAV)、中山病病毒(CHUV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)和牛流行热病毒(BEFV)无交叉反应,表明该方法特异性强;对2种标准品的检出极限均为10 copies/uL,比常规RT-PCR敏感性高10倍;组内和组间重复试验的变异系数均小于2%;用所建立的双重荧光定量RT-PCR方法及常规RT-PCR方法,对100份血液样品和50份病毒液分别进行检测,符合率均大于90%。以上结果表明所建立的双重荧光定量RT-PCR方法具有快速、准确、敏感和稳定等优点,为BTV和EHDV感染的早期快速诊断、高通量检测及流行病学调查提供了有效的技术方法。     

流行性出血病病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立流行性出血病病毒(EHDV)群特异性核酸检测方法,本研究根据GenBank中登录的EHDV毒株内衣壳结构蛋白VP7基因的保守区,设计并合成1对特异性引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、敏感度和临床样品的检测试验。结果表明,该方法能特异性地检出不同地区分离的不同血清型EHDV,而对蓝舌病病毒(BTV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)无交叉反应,具有较好的特异性;不同血清型的EHDV最低检出量级为1×10~2copies/uL。同时,该方法能有效地从临床抗凝血样品中检测出EHDV核酸,与病毒分离试验结果进行比较,符合率为100%。说明所建立的方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于EHDV的快速检测、流行病学调查和试验研究。     

蓝舌病病毒10型和20型及23型多重RT-PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测蓝舌病病毒(BTV)10型、20型及23型的方法,本研究针对这三型病毒VP2基因保守区,设计合成了3对特异性引物,经过条件优化,建立了单管同时鉴别BTV 10型、20型、23型的多重RT-PCR方法。结果显示,该方法可同时扩增出BTV 10型696 bp、BTV20型293 bp和BTV 23型356 bp三条特异性的片段,对BTV其他基因型以及小反刍兽疫病毒(PPRV)、口蹄疫病毒(FMDV)的核酸均无扩增;该方法最低可检测1.696×103copies/L的BTV10、1.375×103copies/L的BTV20和1.317×103copies/L的BTV23。利用建立的多重RT-PCR方法对67份临床样品进行检测,结果与OIE推荐的BTV套式RTPCR方法符合率为100%。本研究建立的多重RT-PCR检测方法特异性好,具有较强的检测敏感性,可用于蓝舌病病毒血清型的鉴别。     

BTV-2型3型4型7型12型HPCE检测方法的建立

为了建立同时鉴别检测蓝舌病毒(BTV)2型、3型、4型、7型及12型的快速方法,针对BTV不同血清型的VP2基因保守区,采用Ge XP原理,设计了5对特异性嵌合引物和1对通用引物,优化建立了可单管同步鉴别BTV2型、3型、4型、7型及12型的HPCE方法。该方法仅对BTV 2型、3型、4型、7型、12型的病毒核酸有扩增,对BTV的其他基因型以及小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒均无扩增,特异性好。敏感性试验结果显示:该方法对单一病毒核酸的最低检测量为100～1 000 copies/μL;对五种血清型病毒混合核酸的最低检测量为100 copies/μL。组内重复试验与组间重复试验结果均一致,重复性好。临床样品和模拟样品检测结果显示,本研究建立的HPCE方法与OIE推荐的套式RT-PCR敏感性一致,且该方法可以特异、敏感、快速地鉴别蓝舌病毒(BTV)2型、3型、4型、7型及12型。     

基于CRISPR/Cas12a技术的非洲马瘟病毒可视化检测方法的建立

根据AHSVS7基因的保守序列,设计、合成和筛选出反转录重组聚合酶介导的恒温扩增（RT-RAA）特异性引物和CRISPR/Cas12a特异性crRNA,结合侧向流试纸建立了一种AHSV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法,并对其性能进行了评估。结果显示,该方法与蓝舌病毒（BTV）、鹿流行性出血热病毒（EHDV）、伪狂犬病病毒（PRV）、马传染性贫血病毒（EIAV）、马动脉炎病毒（EAV）、马流感病毒（EIV）的核酸均无交叉反应;敏感性试验结果显示,本方法最低可检出2.16×101copies/μL的AHSV核酸;应用该方法及WOAH推荐的RT-q PCR方法对50份模拟样品进行平行检测,结果显示,Kappa值为0.956,表明两者具有高度一致性。综上表明,本研究建立的非洲马瘟病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化快速检测方法特异性好、敏感性高,且操作简单、无需特殊仪器,可应用于野外或口岸现场的AHSV快速筛查检测工作。     

猪星状病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

为了建立特异、灵敏及快速的猪星状病毒3型(PAstV3)检测方法并应用于临床检测,根据GenBank登录的PAstV 3序列,在ORF1b保守区设计特异性引物和TaqMan探针;经过反应体系和反应条件优化,对建立的实时荧光定量RT-PCR方法进行敏感性、特异性测定,并初步应用于临床粪便样品的检测。结果显示,该方法标准曲线线性关系良好,R2值达到0.997 1;与多种常见的猪病病毒均无交叉反应,特异性良好。与常规PCR相比,该检测方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高,批内、批间重复性试验的变异系数均小于2.0%,重复性良好。使用该方法对临床收集的30份疑似PAstV3粪便样本进行检测,阳性率为40%,检出率高于常规PCR方法。上述结果表明,该方法的建立为PAstV3的诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

帕利亚姆病毒血清型特异性RT-PCR检测方法的建立

帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)包含多种血清型病毒,我国存在Chuzan virus(CHUV)、Bunyip Creek virus (BCV)和D'Aguilar virus (DAV)三种血清型PALV毒株的流行,目前尚无PALV血清型特异性RT-PCR检测方法的报道。本研究根据获取的中国CHUV、BAV和DAV这三种PALV血清型毒株的Seg-2序列,设计合成了3对特异性引物,建立了PALV血清型特异性一步法RT-PCR检测方法。灵敏度试验结果显示,CHUV、BCV和DAV血清型鉴定引物可分别检测到1.3×10~2 copies、8.0×10~2 copies和5.5×10~2 copies的核酸;特异性试验结果表明,本研究建立的PALV血清型特异性检测方法与蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、非洲马瘟病毒(ASHV)均无交叉反应。本研究建立的PALV血清型特异性RT-PCR检测方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,为开展PALV的诊断与流行病学监测提供了有效的技术手段。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立西藏环状病毒(TIBOV)群特异性核酸检测方法,本研究根据云南师宗新分离的TIBOV(YNSZ/V290/2019)毒株和GenBank中登录的TIBOV毒株VP6基因序列的保守区,设计并合成特异性引物和探针,建立了荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测方法,并分别进行了特异性、灵敏性和临床样品的检测。试验结果表明,两种检测方法均可特异性地扩增TIBOV及检出特异荧光信号,而对帕利亚姆血清群病毒(PALV)、蓝舌病病毒(BTV)、流行性出血病病毒(EHDV)、广西环状病毒(GXOV)、阿卡斑病毒(AKAV)、云南环状病毒(YNOV)、非洲马瘟病毒(AHSV)和牛流行热病毒(BEFV)无扩增和无有效荧光信号检出,具有较好的特异性。灵敏性试验结果显示,荧光定量RT-PCR检测TIBOV核酸的下限可达10 copies/μL,常规RT-PCR的检测下限为10~2copies/μL。临床样品检测显示,两种方法均能检测出库蠓样品中的TIBOV核酸,常规RT-PCR扩增产物经测序和BLAST比对分析显示,库蠓样品中检测到的TIBOV与NCBI数据库中TIBOV(DH13C120、XZ0906、D181/2008)毒株VP6基因序列相似度均在95%以上。荧光定量RT-PCR因其更高的灵敏度和实效性,能用于大量临床样品的快速检测,而常规RT-PCR可以对扩增产物进行胶回收测序,进一步了解待测病毒的遗传信息。两种方法相互辅助,可以为TIBOV的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。     

鹿流行性出血病病毒VP7-ELISA抗体

以原核表达的鹿流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus of deer,EHDV)VP7蛋白为包被抗原,用HRP标记的兔抗羊IgG作为二抗,建立了检测EHDV群特异性抗体的间接ELISA方法(VP7-ELISA).用VP7-ELISA方法检测EHDV阳性血清、其他病毒阳性血清及健康羊血清,结果表明,VP7-ELISA方法具有良好的特异性;用VP7-ELISA和琼脂扩散试验(AGID)检测EHDV阳性血清抗体效价,结果表明,VP7-ELISA的敏感性相当于AGID的8～16倍.用VP7-ELISA和AGID同时检测临床样品188份,VP7-ELISA的特异性和敏感性分别为95.9%和100%,两种方法的符合率为96.3%.表明VP7-ELISA可以代替AGID用于EHDV抗体检测.     

小反刍兽疫病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立

为建立小反刍兽疫病毒(PPRV)可视化RT-LAMP检测方法,本研究根据PPRV基质蛋白(M)基因保守序列设计2对种特异性引物,通过反应条件优化和特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了PPRV可视化RT-LAMP检测方法。结果显示,该方法最佳反应条件为62℃1 h,与口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、狂犬病病毒和犬瘟热病毒这5种羊常见病毒无交叉反应,最低可检测到2.4×10~(-9)ng/L的RNA,敏感性是普通RT-PCR检测方法的1 000倍。该方法与普通RT-PCR的总符合率为95.23%。结果表明,该方法具有敏感性高、特异性好、操作简便、快速和可视化的优点,可用于羊PPRV感染的现场可视化快速诊断检测。     

蓝舌病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

用将纯化的蓝舌病病毒(BTV)免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了3株(1F5、4E5和6A1)可以稳定分泌抗BTV VP7特异性单抗的杂交瘤细胞株.用纯化的BTV免疫家兔,按常规方法制备BTV多抗.选用抗VP7单抗(1F5)包被ELISA板,用兔抗BTV多抗作为捕获抗体,建立了BTV双抗体夹心ELISA检测方法.用该ELISA方法分别检测BTV、鹿流行性出血病病毒、水疱性口炎病毒、赤羽病病毒、小反刍兽疫病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性.用该ELISA和RT-PCR同时检测259份临床样品,ELISA的特异性和敏感性分别为99.1%和85.7%,两种方法的符合率为97.7%.该方法的建立为BTV的检测及蓝舌病的流行病学调查提供了有效工具.     

水泡性口炎病毒双重荧光RT-PCR鉴别检测方法的建立

为建立水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSV-NJ)的快速鉴别检测方法,本研究根据水泡性口炎病毒2种血清型相对保守的L基因为靶序列,分别设计2对型特异性引物和2条不同荧光基团修饰的探针。经过对反应体系的优化,建立了能够同时检测VSV-IND和VSV-NJ的双重荧光RTPCR方法。该方法能准确鉴别VSV两种血清型,与口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等灭活抗原核酸无非特异性扩增,特异性强。与普通RT-PCR相比,反应快速、灵敏度高。Ct值的变异系数小于3%,重复性好。利用所建立方法对126份临床样品进行检测,结果与普通RT-PCR相同。上述结果表明,本研究建立的方法为VSV-IND和VSV-NJ的同时鉴别检测提供了一种快速、特异和敏感的方法。     

禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法的建立

为建立家禽样本中的禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法,本研究通过获得的禽白血病病毒P27融合蛋白与相关单克隆抗体建立了家禽样本中的禽白血病病毒抗原化学发光检测试剂盒。该方法能够特异性地定量检测家禽样本中的禽白血病病毒抗原,敏感性高,特异性强,对其他相关的禽类病原无交叉反应。对该方法的特异性指标、敏感性指标进行了验证,同进口的禽白血病病毒抗原ELISA检测试剂盒进行了比较,结果显示,阳性样品符合率为92.63%,阴性样品符合率为93.17%,总符合率为93.98%。重复性试验的组内与组间变异系数均小于10%,具有良好的重复性。上述结果表明,本研究建立的禽白血病病毒抗原化学发光免疫分析检测方法特异性高、敏感性强,操作简单、快速,具有较高的应用推广价值。     

牛病毒性腹泻病毒Nano-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分子检测方法,本研究利用金纳米颗粒材料与传统PCR技术相结合,针对BVDV 5′UTR保守序列设计引物,建立了BVDV Nano-PCR新型分子检测方法,并与RT-PCR及商品化IDEXX试剂盒BVDV抗原检测方法分别对临床样品进行对比研究。特异性与敏感性试验结果显示,建立的Nano-PCR只对BVDV特异,而对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛副流感3型病毒(BPIV3)均无交叉反应;Nano-PCR敏感性是普通PCR的10倍,最低核酸检测量为6.84×10~2copies/L。临床检测结果显示,建立的Nano-PCR方法对38份临床样品的阳性检出率为34.21%,是RT-PCR的2.6倍,是IDEXX试剂盒的1.5倍。本研究结果表明,建立的BVDV Nano-PCR方法可以用来对临床样品进行快速诊断和鉴定,具有特异性高、灵敏度好、快速稳定的优点。     

一种基于M基因的尼帕病毒TaqMan-MGB荧光RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感和特异地检测尼帕病毒(Nipah virus,NiV)的方法,根据NiV M基因序列保守区设计了1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种检测NiV的TaqMan-MGB实时荧光RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对NiV M基因的RNA标准对照(NiV-M-RNA)发生特异性扩增反应,对猪的其他常见病毒,包括经典猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型均不发生交叉反应。该方法对NiV-M-RNA的最适线性检测范围为4.6×101~4.6×107 copies/μL,标准曲线方程为y=-3.418x+37.57,线性相关系数(r2)为0.999,检测下限为4.6copies/μL。对5个不同浓度(4.6×103~4.6×107 copies/μL)的NiV-M-RNA进行双份样品的4次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.5%,具有良好的重现性。用该方法对368份临床样品进行NiV检测,结果均为阴性。本方法的建立为活猪临床样品中NiV检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立一种特异、灵敏和快速的H11亚型禽流感病毒(AIV)RT-LAMP可视化检测方法。根据H11亚型AIV HA基因保守序列,设计6条特异性引物,优化反应条件,进行特异性、敏感性和临床样品检测。结果显示,该方法只能扩增H11亚型AIV,不与其他亚型AIV和禽病病原体发生交叉反应,表明该方法特异性强;对H11亚型AIV RNA的检测下限为10fg,表明该方法敏感性高;在63℃等温条件下作用1h即可完成全部扩增反应;对206份临床样品的检测结果与病毒分离一致。结果表明,本研究中建立的H11-RT-LAMP检测方法具有简便、快速和结果可视化的优点,尤其适合在基层兽医站和养殖场进行快速检测,具有非常广阔的应用前景。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重荧光LAMP检测方法的建立

本研究为建立一种检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的二重荧光(LAMP)技术,根据已发表的CSFV E2基因和PRRSV NSP2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PRRSV序列的特异性引物和2条探针,在CSFV探针5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PRRSV探针5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。用设计的引物、探针及反应试剂组成反应体系,建立CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法。对建立的方法进行特异性、敏感性、干扰性试验,并用临床样品进行验证。结果显示,本研究成功建立了鉴别CSFV和PRRSV的二重荧光LAMP方法,该方法只检测出CSFV(绿色)或PRRSV(红色)或CSFV和PRRSV混感(黄色),而对照毒株则无荧光颜色出现,具有较好的特异性。敏感性检测CSFV或PRRSV的含量浓度,其最低检测浓度均为100 copies/mL,敏感性较好。干扰性结果显示,高低不同的模板浓度不影响本方法的检测扩增,干扰性小。对112份采集的临床样品进行检测,结果,检出CSFV阳性样品41份,PRRSV阳性样品12份,CSFV和PRRSV同时为阳性的样品3份,该结果与荧光定量RT-PCR方法的检测结果一致。上述结果表明,本研究建立的CSFV和PRRSV二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,并具有检测临床样品中CSFV和PRRSV的潜力。     

猪环曲病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立快速检测猪环曲病毒(PToV)的RT-LAMP方法,根据GenBank中发表的N蛋白基因序列,设计合成4条特异性LAMP引物,通过敏感性试验和特异性试验,建立了PToV RT-LAMP检测方法,并对71份临床粪便进行了检测应用。结果显示,本试验建立的PToV RT-LAMP检测方法在65℃60min条件下可扩增出特异性梯状DNA条带,与猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪环曲病毒的核酸无交叉反应;检测极限为10copies/μL,比普通RT-PCR的灵敏度高10倍,表明该检测方法具有较强的特异性及灵敏性。用建立的RT-LAMP方法进行的样品检测结果显示,受检的71份样品中有17份检测结果为阳性,该结果与常规RTPCR检测结果吻合,总的阳性率为23.9%。     

西藏环状病毒荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立西藏环状病毒（TIBOV）群特异性核酸检测方法，本研究根据云南师宗新分离的TIBOV（YNSZ/V290/2019）毒株和GenBank中登录的TIBOV毒株VP6基因序列的保守区，设计并合成特异性引物和探针，建立了荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR检测方法，并分别进行了特异性、灵敏性和临床样品的检测。试验结果表明，两种检测方法均可特异性地扩增TIBOV及检出特异荧光信号，而对帕利亚姆血清群病毒（PALV）、蓝舌病病毒（BTV）、流行性出血病病毒（EHDV）、广西环状病毒（GXOV）、阿卡斑病毒（AKAV）、云南环状病毒（YNOV）、非洲马瘟病毒（AHSV）和牛流行热病毒（BEFV）无扩增和无有效荧光信号检出，具有较好的特异性。灵敏性试验结果显示，荧光定量RT-PCR检测TIBOV核酸的下限可达10 copies/μL，常规RT-PCR的检测下限为10~(2 )copies/μL。临床样品检测显示，两种方法均能检测出库蠓样品中的TIBOV核酸，常规RT-PCR扩增产物经测序和BLAST比对分析显示，库蠓样品中检测到的TIBOV与NCBI数据库中TIBOV（DH13C120、XZ0906、D181/2008）毒株VP6基因序列相似度均在95%以上。荧光定量RT-PCR因其更高的灵敏度和实效性，能用于大量临床样品的快速检测，而常规RT-PCR可以对扩增产物进行胶回收测序，进一步了解待测病毒的遗传信息。两种方法相互辅助，可以为TIBOV的早期诊断、快速检测、流行病学调查和实验研究等提供有效的技术方法。     

猪δ冠状病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法的建立和应用

为了快速准确地检测猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),本研究根据PDCoV基因序列保守区设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,建立了一种特异性检测PDCoV的TaqMan-MGB荧光定量方法。结果显示,该方法特异性良好,对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型等的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在3.15×108～3.15×101copies/?L范围内具有良好的线性关系;敏感性高,最低检测限为10 copies/?L的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.25%～1.06%和0.58%～1.27%;对临床样品的检测结果显示,本研究建立的荧光定量检测方法对PDCoV的阳性检出率(40%)高于常规PCR方法对PDCoV的阳性检出率(31.7%)。该方法的建立为PDCoV的实验室鉴别诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。