心脏的神经生物活性物质研究进展

综述了近年来有关心脏的神经生物活性物质的研究概况,内容涉及神经肽类的神经降压肽、血管活性肠肽、P物质、降钙素基因相关肽和神经肽Y,以及非肽类的神经生物活性物质一氧化氮和一氧化碳等的分布和机能.     

乳源性生物活性物质

乳是一种成分极其复杂的生物液体 ,有关乳中糖、脂肪、蛋白质、维生素等的研究已比较深入 ,目前已将着眼点主要转移到乳中的生物活性物质。乳蛋白降解产物———活性肽生物学功能的发现是乳营养学、生理学、生物化学、药理学等相关学科的一大飞跃。研究发现 ,乳中含有少量的激素、生长因子、乳铁蛋白、低聚半乳糖和源于酪蛋白的多种活性肽等活性物质 ,这些物质具有极其重要的生理、药理功能。乳源生物活性物质的研究 ,将为利用乳开发有利于人类健康的生物食品、医药保健品及畜禽饲料添加剂提供一条全新的途径。1　乳源性激素及生长因子1.1　…     

肽抗生素的研究进展

科学工作者很早就注意到遭受创伤的青蛙在不干净的水中仍能存活 ,并不受到感染。直到 2 0世纪80年代初期 ,随着蛋白质分离、纯化和鉴定技术的不断提高 ,人们逐渐认识到在青蛙体内存在有抵抗感染的物质———肽抗生素 (peptideantibiotics) ,又称为抗菌肽或抗微生物肽 (antimicrobialpeptide)。最近的研究表明 ,在其他动物、植物及人体内都存在有这一类具有抗菌活性的物质 ,肽抗生素已成为当今生物科学的又一研究新热点。肽抗生素是动物、植物和人体基因组中一段基因编码的一些富含带阳离子氨基酸残基的短肽 ,是生物体内经诱导产生的一种具有…     

内含肽和麦芽糖结合蛋白介导具有抗病毒活性牛α干扰素的表达

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的重组牛α干扰素(BoIFN-α)蛋白,在BoIFN-α基因的上游无缝连接内含肽Ssp DnaB intein(SDI)序列,然后克隆至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的表达载体pMAL-SDI-BoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,且产物主要以可溶形式存在。经直链淀粉树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经MDBK-BVDV(牛病毒性腹泻病毒)干扰素活性系统检测,证实干扰素融合蛋白具有抗病毒活性。     

重组鹅IFN-α蛋白在内含肽-冷激诱导表达系统中的表达

为了在大肠杆菌系统中高效表达具有抗病毒活性的重组鹅IFN-α(GoIFN-α)蛋白,在GoIFN-α基因上游融合内含肽Ssp Dnabmini-intein(SDI)序列,然后克隆至pET-43.1a(+)载体中,再将获得的pET-43.1a(+)-SDI-GoIFN-α重组载体和pColdⅢ载体分别进行双酶切,构建内含肽-冷激表达载体pColdⅢ-Nu-sA-SDI-GoIFN-α,将重组载体转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞,IPTG低温诱导表达。结果表明,融合基因获得高效表达,表达的融合蛋白主要以可溶形式存在。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经CGBQ-GPMV系统检测,证实表达的融合蛋白具有生物学活性,为后续的纯化工作和研究具有天然活性的重组鹅IFN-α奠定了基础。     

鸡β-防御素-8 cDNA在大肠杆菌中的融合表达

为了评价鸡β-防御素的功能与基因工程化生产的可能性,从已构建的重组载体pGEM-T Easy-gal-8中克隆gal-8成熟肽cDNA,将该cDNA插入原核表达载体pGEX-6P-1中,构建表达质粒pGEX-6P-1-gal-8,然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.挑取阳性克隆菌用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果检测显示,融合表达的GST-gal-8蛋白大小约30 ku,经灰度扫描显示该融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的119 mg/L.用固定化的谷胱甘肽亲和层析柱进行蛋白纯化,融合蛋白经Prescission蛋白酶酶切并纯化获得了完整的gal-8成熟多肽.抑菌活性试验显示,表达的gal-8成熟肽对黄色微球菌有一定的抑菌活性.     

血管活性肠肽在皖西白鹅中脑和脑桥内的分布

应用免疫组织化学SABC染色法 ,对血管活性肠肽 (VIP)免疫反应阳性细胞在皖西白鹅中脑和脑桥内的分布进行了观察。结果发现 ,在皖西白鹅中脑的被盖视性核、峡视核、动眼神经核、红核、三叉中脑核和脑桥的脑桥核、桥外侧核、斜方体核、前庭背外侧核均分布有VIP免疫阳性细胞。     

鸡β防御素2在毕赤酵母中的组成型表达及其发酵条件的优化

合成鸡β防御素2(AvBD2)成熟肽基因,构建重组质粒pGHK-AvBD2;将其电转化至毕赤酵母GS115;Tricine-SDS-PAGE和Western-blot检测表达产物,琼脂扩散法测定产物的抑菌活性,并测定产物的溶血活性;响应面法优化接种量、装液量和发酵温度。Tricine-SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,在5.8ku位置出现目的蛋白质条带;抑菌活性检测表明,表达产物对粪肠球菌(ATCC29212)、大肠杆菌(CMCC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)和巴氏杆菌具有明显的抑菌活性;发酵产物在500mg/L时的溶血活性仅2.17%。由建立的响应面模型得到重组酵母最佳发酵条件为:接种量528mg/100mL、装液量8.43%、发酵温度27.8℃,产物蛋白浓度较优化前提高20%。本研究实现了AvBD2在毕赤酵母中的组成型表达,表达产物有较好的抗菌活性,为AvBD2作为新型饲料添加剂的应用奠定了基础。     

犬干扰素α4在CHO细胞中的稳定表达

为制备高活性的犬干扰素α4(CaIFN-α4),将犬IFN-α4和绿色荧光蛋白(GFP)基因用2个GGGGS五肽柔性肽连接,获得犬IFN-α4和GFP的融合基因(CaIFN-α4-GFP)。将该融合基因与真核表达载体pLeGFP连接,构建重组表达质粒pL-CaIFN-α4-GFP,并与其他3种慢病毒质粒(pC-Gp,pR-Rev和pC-VsvG)共同转染293FT细胞,包装获得重组慢病毒(vCaIFN-α4-GFP)。用获得的重组慢病毒感染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,经杀稻瘟菌素筛选、流式细胞仪分选和有限稀释法克隆转染细胞,获得表达CaIFN-α4-GFP的CHO细胞。用荧光显微镜观察构建的CHO细胞呈现绿色荧光,用MDCK与MDB K细胞检测CHO细胞培养上清液具有抗水疱性口炎病毒活性,活性分别为1.39×105和2.19×104U/m L。本研究成功地利用CHO细胞表达了具有活性的犬干扰素α4,为进一步研制高活性的犬IFN-α4生产系统奠定了试验基础。     

重组狮头鹅α干扰素的制备及其抗病毒活性

用PCR方法扩增了狮头鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,并克隆至pET-32a(+)表达载体,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组狮头鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子质量大小约36ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。rGoIFN-α包涵体经过变性、超滤纯化和复性,得到可溶性rGoIFN-α。rGoIFN-α经肠激酶酶切(eGoIFN-α)、亲和纯化获得狮头鹅α干扰素蛋白(GoIFN-α)。rGoIFN-α经Western-blot检测证实是GoIFN-α蛋白。采用微量细胞病变抑制法分析α干扰素的抗病毒活性,复性后纯化的rGoIFN-α的抗病毒活性达1.42×104U/mg;eGoIFN-α的抗病毒活性达8.23×104U/mg,GoIFN-α抗病毒活性达3.34×105U/mg。结果表明,rGoIFN-α能够抑制新城疫病毒Roakin株在鸡胚成纤维细胞中复制。     

密码子优化前后AvBD2成熟肽基因的表达水平及其抑菌活性的比较

根据大肠杆菌的密码子偏好性,将编码AvBD2成熟肽的基因原片段Na-AvBD2优化为片段Op-AvBD2,将2条片段分别转化至大肠杆菌中重组表达,表达产物经GST树脂纯化后,对二者的表达水平和抗菌活性进行了比较。结果,融合蛋白rOp-AvBD2的表达量比rNa-AvBD2高2倍。而两者对大肠杆菌(CM-CC44102)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)和粪肠球菌(ATCC29212)的抑菌活性及对鸡白痢沙门氏菌(CVCC533)和粪肠球菌(ATCC29212)菌体超微结构的破坏程度无显著差异。结果提示AvBD2在预防和治疗细菌感染中具有替代抗生素的潜在应用价值,而密码子优化将成为通过基因工程生产AvBDs的可行途径。     

鸡肺表面活性蛋白A的可溶性表达及活性检测

利用RT-PCR扩增鸡肺表面活性蛋白A(cSP-A)基因,将其连接pMD19-T Simple载体,经测序正确后,扩增成熟肽基因片段并酶切克隆入pCold-TF原核表达载体中,转化到感受态宿主菌BL21(DE3)中,加入不同浓度异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)于16℃诱导表达24h,超声波裂解,通过His·Tag纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE检测。结果扩增得到615bp的成熟肽基因片段;SP-A蛋白获得可溶性表达,融合蛋白的大小为80ku。Western-blot结果显示,该蛋白可被特异性多克隆抗体识别。抑菌试验结果显示,与纯化的天然cSP-A蛋白不同,cSP-A原核表达产物并不具备抑菌活性。     

家兔出血症病毒VP60基因特异性噬菌体展示肽库的构建及鉴定

本研究旨在构建家兔出血症病毒VP60基因特异性噬菌体展示肽库,并选用已知表位序列的单克隆抗体对VP60基因特异性肽库进行鉴定,以确定所构建肽库的特异性和丰富性。利用DNA酶Ⅰ随机消化法构建VP60基因噬菌体随机肽库。采用生物淘选和噬菌体原位杂交技术,选用1B8、1D4、5H3和A3C 4株纯化的单克隆抗体对该肽库进行抗原表位的鉴定。结果显示,所构建多肽库的滴度约为2.6×1012 PFU/m L,能够满足鉴定VP60蛋白的抗原表位的要求,同时鉴定到4条与VP60蛋白高度同源的序列,分别为N(326)PISQV(331)、D(338)MSFV(342)、K(562)STLVFNL(569)和G(25)TTTDGMDPGVVAA(38),与已知单抗所对应的表位序列高度同源。本研究成功构建了家兔出血症病毒VP60基因特异性随机肽库,选用已知表位序列的单克隆抗体对构建的肽库进行鉴定,鉴定到的表位与目前已经报道的单抗针对的表位序列高度同源,表明所构建肽库的特异性和丰富性良好,为进一步筛选和丰富VP60抗原表位奠定基础,还可用于VP60与受体结合域的鉴定,对阐述RHDV的感染、致病和免疫保护机制具有重要意义。     

比格犬α7干扰素成熟肽基因的原核表达及表达产物活性的分析

从比格犬的脾中提取基因组DNA,采用RT-PCR方法扩增比格犬α7干扰素成熟肽基因。将纯化的PCR产物克隆至pMD19-T载体,转化入感受态细胞DH5α中,PCR检测及测序鉴定结果表明,克隆的目的基因为比格犬α7干扰素成熟肽,与GenBank中登录的犬干扰素序列(NM001006654)的同源性达到100%。在此基础上构建重组原核表达质粒pET-32a-CaIFN-α7,并转化至表达宿主BL21(DE3)中。该工程菌在37℃经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约38.4ku处出现了目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经Bandscan软件分析,表达产物约占菌体总蛋白的48.5%。用Protein Refolding Kit对包涵体进行纯化复性,重组CaIFN-α7在犬肾细胞(MDCK)上具有较高的抗病毒活性。     

新型抗体的研究概况

新型抗体是利用生物技术改建和生产的抗体,是近年生物技术研究的一个崭新领域。新型抗体的出现,既扩展了抗体的界限,又延伸了抗体的应用范围,其研究结果不仅显示出重要的理论价值,而且在疾病的预防和诊疗上的意义也日趋明显。目前,已研制和正在研制的新型抗体,大致可归纳成两大类——重组型抗体和新功能型抗体。(一)重组型抗体利用基因工程技术改建生产的抗体,其生物活性仍保持原抗体活性,主要包括有单链抗体、嵌合抗体和重构抗体等。1.单链抗体(Single chain antibody):该抗体由全抗体的部分重链和轻链的可变区,通过一连接肽(约15～25个氨基酸)共价连接起来的重组分子。1988年美国Genex Corp公司的Bird等首先研制出这种抗体。他们在弄清牛生长激素的McAb重链和轻链基因序列的基础上,通过计算机处理抗体X晶体显像,算出可变区三维空间结构及两条链的自然结合状态,设计出编码两个可变区肽段和一个连接肽的融合基因,插入载体,在E.co-li中获得表达。单链抗体是抗体的最小结构单位,     

胸腺九肽对鸡脾淋巴细胞增殖转化及IL-2基因表达与分泌的影响

采用MTT比色法、相对半定量RT-PCR法和放射免疫测定(RIA)法研究了不同浓度的胸腺九肽对离体培养的鸡脾淋巴细胞增殖转化I、L-2基因表达与分泌的影响。结果表明,用10 ng/mL和1 ng/mL胸腺九肽处理鸡脾淋巴细胞8 h后,能显著增加由ConA诱导的淋巴细胞增殖转化反应,显著提高IL-2基因的表达水平以及细胞培养上清液中的IL-2含量(P<0.05);100 ng/mL的胸腺九肽虽有增强脾淋巴细胞增殖转化反应以及提高IL-2基因表达和分泌能力的趋势,但与对照组无显著差异(P>0.05)。提示,胸腺九肽能增强鸡脾淋巴细胞的增殖转化反应,并主要在基因转录水平上促进IL-2的合成与分泌,其作用与剂量大小有关。     

类弹性蛋白多肽融合犬β干扰素的表达纯化和抗病毒活性及体外半衰期的研究

为了研制长效犬β干扰素(Ca IFNb)基因工程产品,用聚合酶链反应从犬基因组DNA扩增Ca IFNb成熟肽编码序列,插入类弹性蛋白多肽(ELP)融合表达载体,将重组载体转化大肠杆菌BLR(DE3),用IPTG诱导Ca IFNb-ELP表达,利用ELP介导的温度敏感可逆相变循环(ITC)进行纯化,用50%细胞病变抑制试验检测干扰素活性,用50%小鼠血浆孵育法检测体外半衰期,并与融合组氨酸标签的His-Ca IFNb进行比较。结果显示,在≤28℃条件下,90%Ca IFNb-ELP为可溶性表达,His-Ca IFNb以不溶性包涵体表达;在优化条件下进行1轮ITC,获得的Ca IFNb-ELP的纯度为96%,显著高于以包涵体纯化的His-Ca IFNb的纯度(85%);Ca IFNb-ELP的抗病毒活性为1×105 U/mg,比His-Ca IFNb的抗病毒活性高10倍;Ca IFNb-ELP的体外半衰期24 h,显著长于His-Ca IFNb的体外半衰期(12 h)。结果表明,Ca IFNb-ELP具有表达水平高、纯化简单和体外半衰期较长等优点,有望作为长效干扰素开发利用。     

凝乳酶的基因工程

基因重组技术,是将DNA链上的基因人为地连接,可创造异种基因的一种技术。现已将这一技术应用于制造干酪所必需的凝乳酶的提取方面。目前世界上干酪制造量的一半以上是用微生物凝乳酶,基因重组技术在这方面的任务是通过微生物大量生产中的凝乳酶,可见其具有较强的实用性和现实意义。为此,Beppu, T. 等人对凝乳酶的基因工程进行了深入的研究,并取得了显著的成就。 (一)凝乳酶原mRNA的提纯 从犊牛第四胃粘膜层分泌的没有活性的前体蛋白(凝乳酶原),分子量约四万道尔顿,365个氨基酸构成的凝乳酶原,其N末端由42个氨基酸构成的肽,在酸性条件下由自身的触酶切除,变成有活性的凝乳酶,Beppu, T. 想从组织的凝     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8 T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。     

胞壁酰二肽类免疫调节剂

胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide,MDP)是分枝杆菌细胞骨架中具有免疫佐剂活性的最小结构单位,可以代替弗氏完全佐剂(FCA)中的整体分枝杆菌,促进机体对外源性抗原的特异性免疫反应。(一)生物活性和应用1.免疫调节作用:MDP在矿物油中能促进不同种属动物对抗原的免疫反应,口服水溶液就能促进抗体生成增加,增强天然疫苗和破伤风类毒素、绿脓杆菌类毒素、乙型肝炎表面抗原(HBSAg)和恶性疟原虫及人工抗原如HBSAg~(16)肽段等的免疫效果。MDP佐剂效力与FCA脂多糖(LPS)或氢氧化铝等相当或稍强。但大剂量多次给药可引起免疫抑制。