猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株和经典毒株的序列差异,分别设计了1对特异性鉴别引物和1条TaqMan探针,建立了检测PRRSV变异株的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果表明,建立的方法可鉴别诊断PRRSV变异株和经典毒株,具有较高的特异性;可以检测相当于1TCID50的病毒模板,比常规RT-PCR方法的灵敏度高100倍;对同一样品进行4次重复试验,变异系数(CV)<10%,具有较好的重复性。应用建立的荧光定量RT-PCR和常规RT-PCR对13份PRRS疑似病例肺组织进行平行检测,结果荧光定量RT-PCR检出11份阳性,高于常规RT-PCR方法。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法能检测高致病性PRRSV变异株,不仅特异性好、灵敏度高,而且快速简便,可用于变异PRRSV的临床诊断和流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用微芯片荧光定量RT-PCR方法的建立和初步应用

为建立一种可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)通用的核酸检测技术,本研究根据已发表的多株PRRSV ORF6(M)基因保守序列,设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,成功建立了一种可用于PRRSV通检的微芯片荧光RT-PCR检测方法。结果显示,该方法特异性强,与多种常见的猪病病毒均无交叉反应;通检性好,可以检出包括美洲型、欧洲型、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及NADC30-like等多种基因型PRRSV毒株;灵敏性好,检测下限为1×10~1TCID_(50)/mL,与常规荧光RT-PCR方法一致;重复性好,批内和批间重复性变异系数均小于4%;且成本低,模板用量少,反应快速,全程仅需61 min;对80份临床样品的检测结果与常规荧光RT-PCR的符合率为100%。本研究建立的微芯片荧光定量RT-PCR技术为PRRSV的快速、通用型检测提供了有力的技术支撑。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型双重荧光PCR检测方法的建立

为建立快速简便检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本研究根据GenBank中已登录的PRRSVORF7基因序列和PCV2 ORF1基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PRRSV和PCV2的双重荧光PCR方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,检测PRRSV和PCV2的灵敏度分别可达1.05 TCID_(50)/100L和6.30 TCID_(50)/100μL,表明,本试验建立的双重TaqMan荧光定量PCR检测方法可对PRRSV和PCV2进行快速诊断,适合现场检测,为这两种疫病的诊断和防控奠定了基础。     

猪流行性腹泻病毒强毒株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别检测方法,针对PEDV基因序列设计3对特异性引物。第1对引物扩增野毒株(经典株、变异株)和疫苗株ORF3基因198 bp和148 bp片段;第2对引物扩增经典株和疫苗株S基因429 bp片段;第3对引物扩增变异株S基因274 bp片段。经过反应条件的优化,建立了能够同时检测并区分PEDV经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR检测方法。该方法可以特异地检测PEDV,而与猪的其他重要病原FMDV、CSFV、PRRSV、TGEV、PRo V、PCV2、PRV无交叉反应;对重组质粒标准品的检出下限为2.62×10~2copies/L;重复试验获得了均匀一致的结果。应用该方法检测336份临床病料,PEDV阳性的120份,其中变异株96份、疫苗株21份、变异株和疫苗株混合感染3份。结果表明,本研究所建立的多重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于PEDV经典株、变异株和疫苗株的快速鉴别检测和流行病学调查。     

猪环曲病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪环曲病毒N基因保守序列设计特异性引物与TaqMan探针,建立猪环曲病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法能检测猪环曲病毒,而对猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、猪星状病毒、A群猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪嵴病毒和伪犬病病毒等核酸的检测均无交叉反应,具有良好的特异性;建立的定量标准曲线Ct值和模板终浓度在109~102copies/L范围内有良好的线性关系,该方法检测灵敏度可达102copies/L;重复性试验的组内、组间的变异系数均小于2.5%。对88份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR检出30份猪环曲病毒阳性,常规RT-PCR检出28份猪环曲病毒阳性,两种方法的符合率为93.34%。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪环曲病毒的快速检测和流行病学调查。     

猪脑心肌炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪脑心肌炎病毒(EMCV)的检测方法,根据GenBank中EMCV 3D基因的保守序列设计并合成1对引物和1条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。该方法线性关系好,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数达到0.998;敏感性高,检测下限为10copies/μL,比普通PCR敏感100倍;特异性强,只有EMCV呈阳性,而与猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、BHK-21正常细胞均无交叉反应;重复性好,组内与组间的变异系数均小于1.5%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株人工感染小鼠的脑、心、脾中的病毒载量进行了检测,同时对临床采集的153份可疑病料进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于EMCV的检测及定量分析。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒及鉴别类NADC30毒株的双重荧光定量PCR方法

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）保守区和类NADC30毒株的双重TaqMan探针荧光定量PCR方法,分别针对保守的N蛋白基因和Nsp2基因设计特异性引物和探针,通过优化反应体系及反应条件对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估。结果显示,双重标准曲线的相关系数（R2）均大于0.990,具有良好的线性关系;最低检测限分别为5.27 copies/μL和3.00 copies/μL,具有较高的灵敏度;不与其他常见猪病病原发生非特异反应,且重复性良好,批内批间变异系数均小于3%。对168份临床样本的检测结果显示,PRRSV总阳性检出率为68.45%(115/168),其中类NADC30检出率为32.14%,混合感染率为20.24%,与临床诊断结果相一致。结果表明,本方法可用于检测PRRSV和鉴别类NADC30毒株以及猪繁殖与呼吸系统综合征的流行病学调查。     

PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法.用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性.应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、14、21 d分别采集全血,检测结果均为阳性.证实,本试验所建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株.     

ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立一种可同时精准、快捷鉴别检测非洲猪瘟病毒(ASFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,本研究选择猪源β-actin为内参基因,根据ASFV的P72基因及PRRSV的ORF6基因设计特异性引物及TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了ASFV和PRRSV多重TaqMan荧光定量PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行验证,并初步应用于临床样品的检测。结果显示,该方法可在45 min内完成对ASFV、PRRSV及猪源β-actin基因的特异性扩增;对ASFV、PRRSV及猪源β-actin标准品模板的最低检测拷贝数分别为7.87×10¹ copies/μL、1.19×10² copies/μL和5.99×103copies/μL,同一模板的3次重复试验的组内及组间变异系数均小于2%;用该方法检测92份临床样品,未检出ASFV,检出19份PRRSV阳性样品。结果表明,本研究建立了一种可快速鉴别检测ASFV及PRRSV的多重荧光定量PCR方法,较普通PCR敏感性高10³倍,可应用于ASFV和PR...     

猪流行性腹泻病毒变异毒株与经典毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异毒株的快速RT-PCR检测方法,根据GenBank中PEDV S基因序列设计合成1对特异性扩增引物,通过优化反应条件,建立了检测PEDV变异毒株的RT-PCR方法。结果显示,建立的RT-PCR鉴别检测方法能特异性区分疫苗株CV777和PEDV变异毒株,仅能扩增出PEDV变异毒株826bp的目的片段,与猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。敏感性试验结果显示,该方法能检测到的最低核酸质量为11.3pg。利用该方法对采集自广西部分地区的123份临床腹泻样品进行检测,临床腹泻样品中PEDV阳性率为67.5%,变异毒株占总PEDV毒株的86.7%(72/83)。结果表明,该RT-PCR鉴别诊断方法特异性强、灵敏度高、操作简单,为猪流行性腹泻的流行病学及病原诊断研究提供了可供借鉴的技术手段。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

猪生殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP检测方法的建立

针对美洲型猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守的N蛋白基因设计了一套RT-LAMP的检测引物,通过优化反应条件,建立了一种检测PRRSV的RT-LAMP诊断方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测美洲型PRRSV,其最低检测限为10个拷贝,而RT-PCR的最低检出限为1×104个拷贝.分别用建立的RT-LAMP法与RT-PCR法对临床50份样品进行检测,结果二者的符合率在96%以上,呈现很好的一致性.表明,建立的RT-LAMP法可应用于PRRSV的快速检测.     

猪丁型冠状病毒TaqMan实时定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中登录的猪丁型冠状病毒(PDCoV)N基因序列在保守区设计合成特异性引物和TaqMan探针,构建含有PDCoVN基因的重组质粒作为阳性标准品,通过优化各项反应条件,建立了检测PDCoV的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,并对该方法进行特异性、定量线性范围、敏感性和重复性等试验。结果显示,该方法仅对PDCoV出现特异性扩增反应,与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、A群猪轮状病毒、猪嵴病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪细小病毒均无交叉反应。该方法的标准曲线Ct值与2.2×10~9~2.2×10~1copies/L之间的质粒浓度具有良好的线性关系,标准曲线方程为Ct=-3.539×lg X+38.95,线性相关系数(R2)为1.0,检测下限为2.2 copies/L。对3个不同浓度(2.2×10~2、2.2×10~4、2.2×10~6copies/L)的pMD18-PDCoV-N进行2次重复检测,每个浓度重复试验的Ct值的变异系数均小于1.0%,表明该方法具有良好的重复性。应用建立的方法对64份广西临床腹泻样品进行检测,结果从其中18份样品中检出PDCo V,样品阳性率为28.1%,说明广西猪群存在PDCoV感染。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法为PDCoV的检测和定量分析提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。     

犬瘟热病毒TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立快速检测犬瘟热病毒的诊断方法,根据GenBank中犬瘟热病毒核衣壳蛋白(NP)基因的保守序列设计1对特异性引物和1条特异性探针,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法对犬瘟热病毒最低检出量为80copies/μL,是常规RT-PCR的100倍;与其他犬类病毒不发生交叉反应;组内、组间变异系数均小于5%。对收集的67份临床样品进行检测,阳性检出率为64.2%,而常规RT-PCR的阳性检出率为44.8%。研究结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR具有良好的敏感性、特异性和稳定性,为犬瘟热的早期诊断提供了技术手段。     

猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立和应用

根据猪嵴病毒3D基因保守序列设计引物和Taq Man探计,通过优化反应体系,建立了猪嵴病毒荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性和重复性评价;同时以10倍梯度稀释的质粒标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线,构建定量分析模型。结果显示,建立的方法能特异性检测猪嵴病毒,与其他引起猪腹泻的病毒无交叉反应,对标准品的检测灵敏度达10 copies/L;标准曲线Ct值和模板终浓度在107~10 copies/L范围内有良好的线性关系;重复性试验变异系数均小于2.5%。对139份猪粪便样品进行检测,荧光定量RT-PCR阳性检出率为30.94%(43/139),常规RT-PCR为29.50%(41/139)。本研究建立的荧光定量RT-PCR可用于猪嵴病毒的快速检测和流行病学调查。     

高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立

应用2株针对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的单克隆抗体(McAb-A61,McAbC65)建立了对PRRSV美洲株、欧洲株和高致病性毒株进行鉴别的间接免疫荧光试验(IFA)方法,并与商品化的PRRSV RT-PCR鉴别试剂盒进行比较.结果显示,McAb-C65与PRRSV美洲株和高致病性PRRSV毒株均呈阳性反应;McAb-A61与PRRSV美洲株呈阳性反应,但不与高致病性PRRSV毒株发生反应;2株单抗都不与欧洲株反应;IFA与RT-PCR的符合率为100%.表明,建立的PRRS间接免疫荧光鉴别诊断方法可为临床高致痛性PRRS的确诊提供可靠的验证手段.     

高致病性PRRSV Nsp2变异株Power SYBR Green real time RT-PCR检测方法的建立

根据高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2变异株Nsp2基因保守区的核苷酸序列设计合成了1对引物,建立了Power SYBR Green模式的实时荧光定量RT-PCR方法,用于检测高致病性PRRSV Nsp2变异株.以pMD-Nsp2质粒为阳性对照制作标准曲线,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行评价.结果显示,该方法只能检测到高致病性PRRSV Nsp2变异株的特异性扩增信号;检测线性范围广,在模板浓度为3.15×109～3.15×100copies/uL具有良好的线性关系,相关系数(r2)为0.998;最低检测限为3.15 copies/uL.对25份疑似高致病性PRRS猪病料的检测结果显示,该方法与病毒分离的符合率为100%.表明,建立的Nsp2-Power SYBR Green RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.     

塞内卡病毒A和脑心肌炎病毒双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立同时快速鉴别检测塞内卡病毒A(SVA)和脑心肌炎病毒(EMCV)的方法,根据SVA和EMCV高度保守的3D基因区域,分别设计了2对特异性引物和带2种不同发光基团标记的TaqMan探针,建立同时检测这2种病毒核酸的双重TaqMan荧光定量PCR方法,并对反应条件进行优化。结果显示,该检测方法对SVA和EMCV的最低检测量分别为760 copies/μL和98 copies/μL,并且能够特异性检测出SVA和EMCV,而对猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等检测结果均为阴性。本方法中所建立的标准曲线呈现良好的线性关系,重复性试验组内和组间变异系数均低于5%,说明该检测方法重复性高。本研究所建立的双重荧光定量PCR具有方便、快速、特异性好、灵敏度高、重复性好等优点,能够用于SVA和EMCV的同时检测。     

牛副流感病毒3型TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)膜蛋白M基因设计引物及探针,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性、重复性进行了测定,并对人工感染BPIV3的牛群临床样本进行了检测。结果显示,建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR的最低检测限为17.6copies/μL,同时进行批内、批间5次重复性试验,变异系数均小于2.5%。应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒1型,结果均为阴性,说明建立的方法特异性较强。用建立的方法检测人工感染BPIV3的犊牛鼻拭子样本,检测结果与样本TCID50的测定结果相符合,但比其更敏感。结果表明,本试验中建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR可以作为BPIV3早期诊断及定量分析的有效技术手段。     

猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为开发一种快速、准确、灵敏及定量检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的实时荧光定量PCR方法,根据GenBank中登录的S基因高度保守核苷酸序列,设计1对PEDV S基因的特异性引物,建立以SYBR GreenⅠ为染料的荧光定量RT-PCR检测方法,对疑似PEDV感染的临床样品进行检测并与普通RT-PCR结果进行比较。结果显示,所建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R~2=1,其扩增效率E=2.03,熔解曲线为尖锐单峰;不与猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪丁型冠状病毒和猪轮状病毒发生交叉反应,具有较强的特异性;最低检出浓度(1×10~1copies/μL)比普通RT-PCR方法灵敏100倍;批内批间重复性试验的变异系数均小于2%,重复性和稳定性好;将36份临床样品检测结果进行比较,与普通RT-PCR的总符合率为88.89%。结果表明,建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏度高,对PEDV的快速及定量检测具有重要意义。