猪细小病毒、猪圆环病毒2型和伪狂犬病病毒多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)核苷酸序列,分别设计并合成了3对特异性扩增PPV、PCV2和PRV的引物,扩增片段长度分别为531、466和277bp。经过优化条件,建立了检测PPV、PCV2和PRV的多重PCR方法。采用该PCR方法对23份自然感染病猪样品进行检测,结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果的符合率为100%,同时对临床样品中PPV、PCV2和PRV阳性PCR产物进行测序分析,发现PPV、PCV2和PRV的PCR产物序列与GenBank中公布序列的同源性均达98%以上,证实该多重PCR检测的阳性结果为上述3种病毒。表明,建立的多重PCR方法可用于这3种病毒的临床诊断和流行病学调查。     

三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查

根据GenBank登录的PRRSVORF7、PCV 2ORF1基因及PRVTK基因的核苷酸序列设计合成引物 ,建立了分别用于检测PRRSV、PRV及PCV 2的RT PCR及PCR方法。应用该方法对 77份可疑病料进行了检测 ,以调查猪群中PCV 2与PRRSV和 (或 )PRV混合感染情况。结果表明 ,2 4份样品表现为PRRSV与PCV 2混合感染 ,占样品总数的 31.2 % ;17份样品检测为PRRSV与PRV混合感染 ;9份样品表现为PCV 2与PRV混合感染 ,占 11.7% ;另外 ,还有一定比例的三重感染 ,共 8个样品 ,占 10 .4 %。结果显示 ,猪群中PRRSV、PRV与PCV 2的混合感染现象比较普遍     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立

根据已发表的PCV 1和PCV 2全基因组序列 ,设计了 3条引物 ,组成PCV 2的特有引物对和PCV 1、PCV 2的共有引物对 ,分别扩增长度为 4 72bp和 339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性 ,将 4 72bp的扩增产物纯化后 ,克隆到 pMD 18 T载体 ,转化大肠埃希氏菌TG1,对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定 ,并测序。将该序列递交NCBI进行BLAST同源序列比较 ,发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV 2毒株核苷酸序列的同源性均在 99%以上 ,与PCV 1毒株的同源性为 86 %。结果显示 ,该方法最少可用于 3μg病料组织和 0 .75 pgDNA的PCV 2检出 ,具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市 4 7份“猪高热综合征”病料 ,PCV 2感染阳性率为 36 .17% ,PCV 1单独感染阳性率为 34.0 4 %。     

猪圆环病毒3型PCR诊断方法的建立

根据NCBI中PCV3的基因组序列,设计了1对特异性引物,并对PCR的反应体系和反应条件进行优化,同时进行特异性和敏感性试验,最后应用所建立的PCR方法检测了临床送检的22份病料。结果显示,建立的PCR方法的最佳反应条件为总体积25 L,退火温度56℃,模板DNA量3 L(l ng/m L),进行35个循环。该PCR能特异地扩增出目的片段,长度约为381 bp。测序结果表明,PCR扩增产物正确。该PCR反应特异性强,只能扩增PCV3阳性样品,且能扩增的最低模板量为1×10-4ng/m L。用该PCR对送检的22份病料进行PCV3检测,结果阳性率为13.6%。可见,本研究建立的PCR方法特异、敏感,可用于PCV3的快速检测。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因的保守序列,设计合成了1对特异引物和1条探针,以PCV2全基因阳性质粒作为标准品,经反应条件优化,建立了一种检测PCV2的荧光定量PCR方法。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果显示,该方法可特异地检测PCV2,而与PCV1等猪病病毒不发生交叉反应;该方法的灵敏度可达1×102copies/μL,比常规PCR高100倍;3次重复检测的变异系数均小于5%。用建立的荧光定量PCR和常规PCR分别对94份临床样品进行检测,荧光定量PCR的阳性检出率为51.06%,而常规PCR的阳性检出率仅为38.30%。证实,建立的方法具有快速、特异、灵敏、重复性好、定量、安全等优点,可用于PCV2的临床检测。     

猪圆环病毒2型基因型鉴别PCR检测方法的建立

采用PCR方法从猪圆环病毒2型(PCV2)山东分离株中扩增ORF2基因片段,结合GenBank中已登录的PCV2基因序列进行同源性分析及基因型鉴定,确定山东省PCV2的流行优势基因型,探讨PCV2基因的遗传变异特性。依据PCV2基因型间的差异性序列,设计、合成特异性PCR引物,建立PCV2基因型鉴别PCR检测方法,并从敏感性、特异性、重复性等方面评价其性能。结果,获得了28株PCV2ORF2完整基因,其中4株为PCV2a型,21株为PCV2b型,3株为新基因型PCV2d型,显示山东省流行的PCV2优势基因型为PCV2b。基因同源性分析表明,2000-2012年国内不同地区分离株的基因同源性为90.5%~99.8%,不同基因型PCV2存在一定形式的特有氨基酸位点序列。用建立的PCV2基因型鉴别PCR方法扩增的片段大小分别为341bp和177bp,该方法最低能检测病毒DNA的量为5ng/μL;特异性试验结果显示,该方法只对PCV2a和PCV2b的DNA扩增阳性,而对猪圆环病毒1型(PCV1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙型脑炎病毒(JEV)和大肠杆菌(Escherichia coli)的扩增结果均为阴性;重复检测10次的结果均一致。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性和重复性,可用于PCV2基因型的鉴别检测。     

马泰勒虫不同PCR检测方法的比较

为寻求一种快速、有效的马泰勒虫PCR检测方法,用Bec-UF2、Equi-R;EMA-1F、EMA-1R两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的核蛋白体基因和表面蛋白基因进行了常规PCR方法检测,用EMA-5、EMA-6;EMA-7、EMA-8两对引物对56份马血液样本中马泰勒虫的表面蛋白基因进行了PCR和套式PCR方法检测。结果显示,以Bec-UF2、Equi-R为引物的PCR方法的阳性检出率为57.1%(32/56),以EMA-5、EMA-6;EMA-7、EMA-8为引物的套式PCR方法的阳性检出率为51.8%(29/56),以EMA-1F、EMA-1R为引物的PCR方法的阳性检出率为17.9%(10/56)。结果表明,以Bec-UF2、Equi-R为引物的常规PCR方法为检测马泰勒虫的最佳方法。     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2.将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在.证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性.     

鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR的建立与应用

为了快速鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)的2个基因型PCV2a与PCV2b,根据PCV2a和PCV2b基因序列特征,设计PCR引物,成功建立了鉴别检测PCV2a与PCV2b的PCR,并进行了敏感性试验和特异性试验。结果显示,该方法对PCV2a和PCV2b的敏感性分别为9.74fg/μL和16.3fg/μL;与猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等没有交叉反应性。用该方法对采自我国华东地区的125份断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的淋巴组织样品进行检测,结果显示,单独感染PCV2a占8.0%(10/125),PCV2b占41.6%(52/125),PCV2a或PCV2b共感染占50.4%(63/125)。选取PCV2a或PCV2b单独感染的淋巴结组织病料进行病毒分离和全基因序列分析,结果分离获得4株PCV2b和1株PCV2a,与该鉴别PCR的检测结果一致,说明本研究建立的PCR可以有效鉴别PCV2a与PCV2b,具有较高的特异性和敏感性,可用于断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的临床样品中PCV2的快速检测。     

鉴别PCV2b与PCV2d基因亚型PCR方法的建立及应用

为建立可鉴定PCV2b和PCV2d基因亚型的PCR方法,通过分析Gen Bank内PCV2 ORF2基因序列,设计了可分别扩增ORF2基因和鉴别PCV2b、PCV2d的引物,并建立PCR方法。应用PCV2b和PCV2d引物扩增108份PCV2阳性样本,选择11份PCV2b和19份PCV2d单一阳性样本扩增ORF2基因序列,并用于遗传进化分析。结果显示,PCV2b和PCV2d引物扩增的敏感性较好,PCV2b和PCV2d最低可扩增基因拷贝数分别为19 copies/L和80 copies/L。108份PCV2阳性DNA中PCV2b阳性率为42.5%,PCV2d阳性率为69.4%,混合感染阳性率为12%。30条ORF2序列的遗传进化分析结果显示,11条为PCV2b基因亚型,19条为PCV2d基因亚型,遗传进化分析结果与PCR结果一致。本试验建立了一种鉴别PCV2b和PCV2d的PCR方法,可用于PCV2流行病学的调查。     

Prohibitin 2基因参与猪圆环病毒2型PK-15细胞感染的研究

为探究Prohibitin2(PHB2)在PCV2感染细胞过程中发挥的作用,首先通过间接免疫荧光试验检测PCV2在PK-15细胞中的增殖变化,同时建立PHB2荧光定量PCR检测体系,然后以PCV2已知的宿主细胞互作蛋白gC1qR为对照,检测PCV2感染PK-15细胞后PHB2 mRNA的动态变化,最后鉴定PHB2 siRNA转染PK-15细胞中PCV2 Cap的表达。结果表明,PHB2在正常及PCV2感染的PK-15细胞中均有效表达。随着PCV2感染PK-15细胞,gC1qR转录水平在病毒感染3 h显著降低,感染6 h时升高,随后(12~48 hpi)转录水平下降;而PHB2转录水平在PCV2感染6 h内显著升高,随后(12~48 hpi)mRNA水平有所下降;RNA干扰PHB2对PCV2在PK-15细胞中复制起到显著的抑制作用。上述研究结果表明,PCV2可显著影响PK-15细胞中PHB2转录,而且PHB2对PCV2病毒复制具有调节作用。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

2008～2009年浙江省猪圆环病毒2型全基因组序列的比较和分析

应用PCR方法对2008～2009年采集的99份疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征病猪的脾、肺、淋巴结混合组织样本进行猪圆环病毒2型(PCV2)检测,并以组织DNA为模板进行了PCV2的全基因组扩增,克隆后进行了测序。结果显示,2008年与2009年浙江省PCV2的平均阳性率为47.5%,与2004～2006年相比基本持平。随机选取18份阳性病料进行PCV2全基因组测序分析,结果,18个毒株均属于Group1,其中5个毒株(27.8%)属于1A分支,3个毒株(16.7%)属于1B分支,9个毒株(50%)属于1C分支。表明,Group1依然是浙江省PCV2的主导基因型,且1C分支从无到有,并逐渐占据主导地位。     

表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。     

规模化猪场猪圆环病毒2型感染的血清学调查

用ELISA方法对甘肃省酒泉、张掖、武威、兰州、临夏、白银、定西 7市 (州 )及青海省大同地区的 12个规模养猪场或个体养殖户送检的 2 19份猪血清进行了猪圆环病毒 2型 (PCV2 )抗体检测。结果 ,抗体阳性血清 12 8份 ,其中母猪血清 75份 ,仔猪血清 5 3份 ;总抗体阳性率为 5 8.4 5 % ,母猪抗体阳性率为 6 3.2 5 % ,仔猪抗体阳性率为 5 2 .94 % ;同时对张掖市及大同地区的猪场进行了跟踪调查 ,张掖市 2、3、4和 6月份的阳性率依次为 12 .5 0 %、4 2 .11%、75 .0 0 %和 97.4 2 % ,青海大同地区 4月份和 8月份的阳性率依次为 12 .5 0 %和 85 .71%。表明两地的PCV2感染率随气候变暖而呈明显上升的趋势。     

猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法.用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应.该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验.用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%.另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%.表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重.     

西宁市猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测了西宁市8个规模养殖场和部分散养户的161份猪血清样品的猪圆环病毒2型(PCV2)抗体。结果显示,所有被检猪场均有PCV2抗体阳性猪存在,161份血清样品中PCV2抗体阳性率为86.95%。从上述样品中随机抽取28份样品,用PCR方法检测了PCV2 ORF1基因;结果,从13份血清中扩增到了特异性PCV2 ORF1基因,阳性率为46.42%。证实,西宁市猪场和散养猪群中存在PCV2感染。     

猪圆环病毒2型XJ-SW株全基因组的克隆与序列分析

应用PCR方法对采集自新疆沙湾地区某猪场的疑似仔猪多系统衰竭综合征病料猪圆环病毒2型(PCV2)全基因组进行了扩增,确定了2份病料中的PCV2的分子特征,命名为XJ-SW1、XJ-SW2(Gen-Bank登录号:JN639856,JN639857)。经对阳性样品进行克隆、测定,并应用软件进行全基因组核苷酸序列比对分析。结果显示,2株病毒的基因组全长均为1 768nt;XJ-SW1株与我国山东DE株(GenBank登录号:HM142897)的同源性最高(为97.91%);XJ-SW2株与韩国G2284株(GenBank登录号:JF317587)的同源性最高(为97.51%)。PCV2全基因组序列的进化分析表明,2株病毒为PCV2e基因亚型;对2株病毒与5个不同基因亚型的15株病毒的ORF2氨基酸序列进行比较,结果显示,XJ-SW1、XJ-SW2在ORF2的氨基端与PCV2d同源性较高,在羧基端与PCV2e同源性较高。表明,在新疆沙湾猪场流行的PCV2毒株为PCV2e,该毒株的ORF2存在一定变异。     

2007-2011年广东省猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解广东省2007-2011年猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株的遗传变异情况,采用PCR方法对本实验室分离到的49株PCV2分离株进行全基因组克隆和序列分析。所分离的毒株全长分别为2株1 766bp、45株1 767bp、2株1 768bp。通过序列比对进行遗传变异分析,无论是这49株病毒间还是与GenBank中的8株PCV2基因组间的核苷酸同源性均为93.2%～99.9%;在遗传演化关系上,49株分离株分布于2个大群,分别为PCV2b和PCV2d分支。提示目前疫苗毒株不处于广东地区PCV2流行毒株分支中,应该引起高度的重视。     

PCV2感染对猪MCP-1和IL-8 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间宰杀,收集肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用竞争PCR技术测定趋化性细胞因子IL-8和 MCP-1 mRNA水平,分析PCV2感染对其mRNA表达的影响。结果显示,与对照组相比,在 PCV2感染后第7 d,IL-8 mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至第14 d时达到高峰,而后快速下降,但仍维持较高水平;MCP-1 mRNA水平在攻毒后第3 d下降至最低,之后逐渐上升,至第14 d时达到高峰,而后下降,第21 d以后恢复正常。结果表明,PCV2感染初期可导致PAM趋化性细胞因子IL-8和MCP-1基因的转录明显下调。