猪囊尾蚴体外培养代谢物的测定与分析

通过对猪囊尾蚴2及24小时的体外孵育,检测了孵育液中蛋白、硷性磷酸酶及尿酸含量,并以聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对孵育液蛋白做了电泳分析。证实了孵育液中含有一定量的蛋白和尿酸。蛋白电泳显示孵育液蛋白有三条带,与囊液及头节囊壁组织蛋白电泳比较,蛋白成分简单,属中、小型分子。并对孵育液蛋白性质做了初步探讨。对蛋白和尿酸存在的意义进行了分析。     

人工感染猪囊尾蚴的组织结构观察

为了解成熟猪囊尾蚴的组织结构,进一步研究其特异性抗原定位,对猪带绦虫病患者用槟榔、南瓜子驱虫,采集虫卵,人工感染猪,收集新鲜猪囊尾蚴,石蜡切片,HE染色后进行了光镜观察,并用胆汁法翻出头节,超薄切片,进行了透射电镜观察.光镜观察表明,囊尾蚴有2个囊腔,较小的囊腔包括头节和颈节,较大的囊腔包括囊壁和囊液,囊壁外层具有绒毛,并有宿主结缔组织的成分;电镜观察表明,翻出头节的囊尾蚴除与已报道的未翻出头节的囊尾蚴结构相同外,最突出的特点是神经索和排泄管并行,石灰小体呈板层状.     

猪囊尾蚴体外培养及中药合剂对囊尾蚴的杀灭作用

猪囊尾蚴病是严重危害人体健康和养猪业发展的重要人畜共患病。医学和兽医科学工作者为防治人的猪带绦虫病和猪的囊尾病进行了大量的研究，已取得一定进展，本试验旨在探索囊尾蚴体外孵育的最佳条件，验证中药合剂ＯＬＳ的药理作用。１材料与方法１．１猪囊尾蚴采自东北农...     

分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

用羊肝囊液纯化抗原免疫BALB/c鼠,取鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞融合,经筛选及克隆化培养,获得3株分泌McAb的杂交瘤细胞株1D_3、3H_(11)和9E_(11)。3株McAb均属IgG_1亚类,能与人源和羊源的细粒棘球蚴囊液抗原反应,不与细颈囊尾蚴、肝片吸虫、脑包虫或弓形虫抗原反应。腹水中抗体的IHA最高效价可达2~(-13)。杂交瘤细胞经冻存、复苏和连续传代培养,分泌抗体性质稳定。     

亲和层析纯化棘球蚴囊液特异性抗原的研究

本文应用兔抗健康羊IgG吸附柱、兔抗羊细颈囊尾蚴IgG吸附柱分别对绵羊棘球蚴囊液粗抗原进行了亲和吸附,制得了亲和纯抗原,并用ELISA法测定其抗原性。试验表明,经过兔抗羊细颈囊尾蚴IgG吸附柱吸附后的抗原,与非疫区绵羊血清反应的OD值都低,而与疫区血清反应的OD值都较高。经过兔抗健康羊IgG吸附柱吸附后,在不影响阳性检出率的情况下,可以降低阴性血清所致的假阳性反应,同时提高了细颈囊尾蚴的检出率。     

绵羊棘球蚴囊液抗原在IHA中的特异性研究

本研究应用粗制绵羊包囊液作抗原致敏经戊二醛处理的鞣酸化绵羊红细胞,进行微量间接血凝试验(IHA),检测棘球蚴病羊血清400份、健康羊血清45份、细颈囊尾蚴病羊血清13份、肝片吸虫病羊血清21份、边虫病羊血清20份、多头蚴病羊血清1份,阳性反应率依次为83.1％、13.33％、33.46％、4.35％、0％、0％。以40％饱和硫酸铵盐析抗原对上述健康羊血清、细颈囊尾蚴病羊血清及96份棘球蚴病羊血清的检测结果依次为13.33％、38.46％、87.5％。对分段盐析的其他组份及葡聚糖凝胶层析抗原、醋酸盐析抗原、牦牛肺包囊液抗原、鼠包囊液抗原也进行了初步试验,均未获得满意结果。     

盐析囊液抗原用于ELISA诊断绵羊包虫病的试验

寄生蠕虫的共同抗原多为体抗原,特异抗原多为分泌/排泄抗原。包虫囊液中含较丰富的分泌/排泄产物,是获取包虫特异抗原的主要来源。但是囊液中还含有共同抗原和宿主体液成份,这是造成交叉反应和假阳性反应的因素。用包虫粗囊液作为抗原建立的诊断方法,往往特异性差、灵敏性低、囊液抗原成份不易标准化。本试验将盐析囊液抗原用于ELISA,以验证其在绵羊包虫病诊断中的灵敏性和特异性。     

猪囊虫B抗原的研究进展

近年来,有关科技人员对猪囊虫抗原进行了研究。认为猪囊虫抗原成分十分复杂,头节和囊壁混合的匀浆液中含有20余种蛋白质,其中有8种以上的抗原性成分。Flisser(1980)把猪囊虫的头节和囊壁匀浆粗提后,通过免疫电泳对116份阳性血清所产生的沉淀线进行分析。结果表明,pH8.6等电成分B抗原可同84％阳性血清反应,在被阳性血清识别频率方面,居诸抗原之首。用从猪体收获的囊虫提取物接种小鼠时,B抗原也是被超免鼠血清最频识别的抗原。因此,在猪囊虫病的免疫学研究中,B抗原是十分引人注目的。 (一)B抗原的提纯 Guerra等人(1982)对B抗原提纯作了研究。首先是将去囊液的     

囊尾蚴病猪治愈前后胴体氨基酸分析

囊尾蚴病猪肌肉中寄生了数量不等的囊尾蚴虫体,经药物治疗后,治愈的胴体营养成分是否能够恢复正常,尚未见有报道。我们曾对经治疗达到鲜销猪的胴体进行了一些研究,对肉眼观察已经恢复正常的胴体,经病理组织学研究证明囊虫体所占据的空间位置已被肌细胞填充,经过一定的理化学分析证明胴体的蛋白质、脂肪等含量与健康猪体没有明显差异。但其氨基酸的含量是否受到影响,治愈前后与健康猪胴体氨基酸相比较有无差异,笔者就此问题对囊尾蚴病猪、治愈猪胴体和健康猪胴体的氨基酸含量进行了对比试验,现报告如下。(一)材料与方法1.试验动物:第1组(未治组):经改良酶标判定为强阳性的囊尾蚴病猪3头,宰后来集不同部位肌肉备用。第2组(治愈组):改良酶标诊断为强阳性的囊虫病猪3头,以30mg/kg剂量投服     

猪囊尾蚴病免疫原的分子生物学研究进展

猪带绦虫有成虫、虫卵、六钩蚴、囊尾蚴不同形式的发育阶段和寄生状态 ,不同的虫体形式以独特的组织结构和生命活动规律满足其寄生在相应宿主体内的需要[1 ,2 ] 。研究发现 ,六钩蚴与囊尾蚴在虫体组成成分、生化指标以及代谢 (分泌 )产物等方面都有差异。SDS PAGE和免疫印迹研究表明 ,六钩蚴的抗原成分非常复杂 ,不仅有共同抗原、阶段发育特异性抗原 ,而且在入侵宿主定植在肌肉组织后 ,表面抗原随虫体的发育而发生阶段性的改变 ,并且抗原变异的发生往往比免疫应答更为迅速 ,从而使宿主产生的抗体失去保护性。在生化指标及代谢关键酶方面 …     

猪带绦虫HSP70-4的真核表达及其抗血清的制备

为了研究猪带绦虫(Taenia solium)热休克蛋白70-4(TsHSP70-4)基因序列的特征及其真核表达蛋白的抗原性,参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,设计特异性引物,RT-PCR扩增TsHSP70-4 ORF序列。根据毕赤酵母密码子偏好性,对TsHSP70-4基因密码子进行优化,连接载体pPIC9K,在毕赤酵母中进行诱导表达,通过Western-blot及质谱测序进行蛋白鉴定。将纯化后的TsHSP70-4表达蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果显示,成功克隆出大小为1 953 bp的TsHSP70-4 ORF序列。在毕赤酵母中进行了高效表达,获得大小约为95ku的重组蛋白。Western-blot检测和质谱鉴定表明,获得的重组蛋白即为TsHSP70-4。免疫新西兰大白兔,制备出效价高达1∶409 600的抗血清。该研究为猪囊尾蚴病新疫苗的研制提供了依据。     

猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂Tsserpin570的克隆表达与酶活性分析

为阐明猪带绦虫(Taenia solium)丝氨酸蛋白酶抑制剂(Tsserpin570)对蛋白酶的抑制作用,通过RT-PCR从猪带绦虫成虫cDNA扩增获得Tsserpin570(TsM_000807300)的完整CDS序列,并构建了pColdTsserpin570原核表达载体,利用发色底物法检测可溶性重组蛋白Tsserpin570对蛋白酶活性的抑制作用。结果显示:RT-PCR扩增获得的Tsserpin570基因片段长1 206 bp,其蛋白的分子质量为46 ku,含有serpin家族特有的反应中心环及DEEGAE和FIVDHPFLFFI家族保守序列。qRT-PCR结果显示,Tsserpin570基因在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达,且在成虫的表达量显著高于囊尾蚴的。pCold-Tsserpin570原核表达载体经IPTG诱导表达后获得可溶性重组蛋白Tsserpin570,可被猪囊尾蚴阳性血清识别。基于发色底物法检测Tsserpin570对牛α-胰糜蛋白酶、猪胰弹性蛋白酶、猪胰蛋白酶、人白细胞组织蛋白酶G、人血浆凝血酶、猪胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等蛋白酶的活性抑制作用发现,其对牛α-胰糜蛋白酶、胰蛋白酶及弹性蛋白酶的活性均有明显的抑制作用。以上结果提示,Tsserpin570对多种丝氨酸蛋白酶均具有较强的抑制作用。     

伪狂犬病病毒gE基因的表达及gE蛋白单克隆抗体的制备

以猪伪狂犬病病毒(PRV)Min-A株pMD-gE质粒为模板,利用所合成的特异性引物进行PCR扩增,获得了1 000 bp的DNA片段,并将其克隆至表达载体pET-30a中,转化到大肠杆菌中进行了原核表达,对表达产物进行了抗原性分析;在此基础上,用纯化的gE蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选和鉴定了分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株。结果显示,原核表达的gE蛋白具有良好的抗原性,其分子质量为46 ku。筛选获得3株分泌抗gE蛋白单抗的杂交瘤细胞株,Western-blot和间接免疫荧光试验证实,所获得的3株单抗具有良好的特异免疫反应原性。3株单抗均为IgG1亚类,且轻链均为κ链。     

抗猪传染性胃肠炎病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

应用杂交瘤技术获得了1株分泌抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞2D6。经检测,其分泌的抗体亚类为IgG3;杂交瘤染色体数为88;间接ELISA检测细胞培养上清液效价为1∶256,诱生腹水抗体效价达1∶6×104,与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、猪致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)以及禽传染性支气管炎病毒(IBV)抗原之间均无交叉反应;ELISA阻断试验表明,TGEV特异性阳性血清对TGEV-McAb有明显的阻断作用,该McAb所识别的抗原是TGEV所特有的抗原决定基。     

豆状囊尾蚴外泌体的分离鉴定及其对家兔免疫应答的调节作用

为探究豆状囊尾蚴外泌体对家兔免疫应答的调节作用,以收集的豆状囊尾蚴分泌排泄产物(ESP)为材料,通过差速离心法分离外泌体,经透射电镜和Western-blot分别对其形态和标志分子进行鉴定。分别用外泌体和ESP免疫家兔,ELISA方法检测家兔血清中特异性抗体和血清细胞因子水平,并通过人工攻虫感染评价其免疫保护效果。结果显示,豆状囊尾蚴外泌体直径为30~150 nm,呈圆形或椭圆形,有完整的脂质双分子层膜结构,且含有外泌体标志蛋白CD63。而且,外泌体免疫组血清特异性抗体、IL-10和IL-4的水平显著升高(P<0.05),而IFN-γ和TNF-α显著降低(P<0.05)或差异不显著。经剖检发现,豆状囊尾蚴ESP免疫组和外泌体免疫组的减虫率分别为65.17%和24.88%。结果表明,外泌体通过上调宿主抑炎因子的表达,诱导宿主产生了Th2型细胞免疫应答,从而有利于囊尾蚴在宿主体内的存活。     

猪伪狂犬病病毒IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立检测猪伪狂犬病病毒(PRV)黏膜免疫时特异的IgA抗体的间接ELISA方法,本研究采用PCR方法扩增了PRV gB基因截短片段,并将其连入原核表达质粒pGEX-6P-1,构建的表达质粒转化至大肠杆菌Transetta(DE3)菌株后,采用IPTG进行诱导表达,得到gB重组蛋白的可溶性表达,并用谷胱甘肽亲和层析柱进行蛋白纯化。以纯化的gB重组蛋白作为包被抗原,以山羊抗猪IgA-HRP为二抗,建立了猪伪狂犬病病毒IgA的间接ELISA检测方法。经ELISA反应条件优化,确定抗原包被浓度为2.4μg/mL,封闭液为10 g/L明胶,一抗37℃孵育1.5 h,二抗1∶20 000稀释后37℃孵育0.5 h,TMB显色液显色10 min。该方法的批内和批间变异系数均小于10%,重复性较好。利用该间接ELISA方法对PRV黏膜免疫的仔猪进行检测,结果可以在鼻腔黏液中检测出特异的IgA抗体。本试验为PRV黏膜免疫提供了初步检测方法。     

猪带绦虫TS61抗原基因的克隆及表达分析

以PCR扩增猪带绦虫TS61抗原基因 ,与载体 pUC18连接后进行测序 ;并构建了该基因的pGEX 1λT原核表达载体 ,制备了其原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS PAGE和免疫印迹分析 ;对该基因的碱基序列及其编码蛋白进行了同源性比较。结果表明 ,猪带绦虫TS61抗原基因含 893对碱基 ,编码含 70个氨基酸残基的多肽 ,分子质量为 8.0ku ,等电点为4.19。在基因库和欧洲分子生物学实验室数据库中均未发现该基因的同源序列。重组质粒在大肠埃希氏菌中表达的融合蛋白分子质量为 3 4ku ,该蛋白抗原能被兔抗猪囊尾蚴超免疫血清所识别。     

猪水泡病病毒三种抗原颗粒的特性

曾用蔗糖和氯化铯梯度离心法从猪水泡病病毒的细胞培养收获物中分离到三种不同的颗粒。病毒粒子(148S)、无RNA空衣壳(81S)和一种也无RNA的第三种颗粒(49S)与猪水泡病病毒抗血清都显示出了免疫反应性。81S和49S颗粒具有自然产生的空衣壳典型的多肽。曾用纯化抗原注射给天竺鼠制备了用免疫扩散法可以区别空衣壳和病毒粒子的抗血清;49S抗原似乎与病毒粒子类似。用在幼小白鼠脑内繁殖,新制备的病毒抗原制造的抗血清,可区别猪水泡病病毒和在血清学上与其相关的科赛奇B_5病毒,但是不能区别各种沉降颗粒抗原。当在天竺鼠血清中孵育时,部分纯化病毒制备物将降解为空衣壳。本文讨论了空衣壳和49S颗粒可能的来源以及它们与病毒制备物抗原性的关系。     

非洲猪瘟病毒抗体量子点检测试纸条的研制

根据非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73蛋白的氨基酸序列推测抗原表位优势区域,合成多肽并与牛血清白蛋白(BSA)偶联,筛选有抗原性的多肽作为试纸条检测线的包被抗原,采用量子点作为标记材料对葡萄球菌蛋白A(SPA)进行标记,以抗SPA的多克隆抗体作为质控线的包被蛋白,制备快速检测ASFV抗体的量子点免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条与常见相关猪疫病阳性血清无交叉反应,与进口ELISA试剂盒对临床样品的检测符合率为100%;特异性强、敏感性高、稳定性好、操作简便,可用于ASFV抗体的快速检测和流行病学调查。     

猪囊虫特异抗原的提取和应用的研究

将细颈囊尾蚴和棘球蚴的粗抗原超免家兔,从抗两种粗抗原的兔血清中提取γ球蛋白与CNBr活化的Sepharose 4B偶联制成免疫吸附柱进行亲和层析,排除猪囊虫粗抗原中与细颈囊尾坳和棘球蚴的共同抗原,得到纯化的猪囊虫特异抗原SACC。用SACC进行斑点试验(DIA)诊断猪囊虫病,结果表明,SACC不仅具有较强的特异性(99.62％),而且其敏感性(98.30％)与粗抗原的敏感性(98.86％)比较也没有明显降低。经免疫电泳分析也证明SACC是猪囊虫的特异性抗原。