鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

金黄色葡萄球菌疫苗候选分子StbA主要抗原表位区的表达及重组蛋白抗血清的制备

通过生物信息学软件分析金黄色葡萄球菌转铁蛋白结合蛋白(StbA)的主要抗原表位区,PCR扩增StbA主要抗原表位区的编码序列;将该序列插入表达载体pGEX-4T-1中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌能表达出分子质量约为54 000u的重组融合蛋白。表达产物经亲和层析纯化后可获得较高纯度的目的蛋白。Western-blot检测证实该重组蛋白能与乳腺炎患病奶牛恢复期血清发生阳性反应。ELISA结果显示,重组蛋白免疫新西兰大白兔能产生高效价的抗血清,提示StbA主要抗原表位区能刺激机体产生强大的免疫应答,StbA是一个有潜力的保护性抗原候选分子。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。     

传染性法氏囊病病毒vp3基因在昆虫细胞中的表达及其ELISA抗原反应性的分析

为分析传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组VP3蛋白的ELISA抗原反应性,将IBDVvp3基因插入杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建重组供体质粒pFastBacHTA-vp3并转化大肠杆菌DH10Bac感受态细菌,经抗性筛选获得重组杆状病毒表达质粒pBac-vp3。用pBac-vp3转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒vBac-vp3。对重组杆状病毒感染的Sf9细胞用Western-blot检测,在33ku处存在一条特异的蛋白条带;用间接免疫荧光试验检测时可见特异性荧光。以纯化的重组VP3蛋白为包被抗原建立了检测IBDV抗体的间接ELISA(VP3-ELISA),并与重组VP2蛋白包被抗原建立的VP2-ELISA和全病毒抗原ELISA(IDEXX-ELISA)进行了比较。对42份不同鸡血清中IBDV抗体的检测结果显示,VP3-ELISA的区分度低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA阳性检出率低于VP2-ELISA和IDEXX-ELISA;VP3-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数低于VP2-ELISA与IDEXX-ELISA的相关系数。结果表明,在昆虫细胞中表达的重组VP3蛋白具有良好的特异性和抗原反应性,用它建立的ELISA的抗原反应性弱于用重组VP2蛋白和IBDV全病毒抗原建立的ELISA的抗原反应性。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用RT-PCR扩增了猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗株(C株)的E2蛋白主要抗原区(tE2)编码区,并定向克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组表达载体pPROEX-tE2,将其转化大肠杆菌DH5α菌株,经IPTG诱导,tE2蛋白获得高效表达;经检测,该重组蛋白能被CSFV C株抗血清识别.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了1株稳定分泌抗tE2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株.经检测,该单克隆抗体能够与CSFV C株和石门株以及杆状病毒表达的重组E2蛋白发生特异性反应.推测,该单克隆抗体是针对CSFV E2蛋白的一个保守线性表位.     

IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1 461 bp的VP2基因,将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3) 中成功表达了53．7 ku的蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示,VP2表达产物以包涵体形式存在,可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性,用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测,结果,复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍;用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA,结果显示,VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3C7反应强( );与4E4、1H11反应中度( );与4E5、3C4、 1E11、3H9反应较弱;而与EC6、3D12、1A1无反应。     

消除副结核菌交叉反应机理的探讨

本试验用吸收处理、免疫转印技术分析了5种分枝杆菌抗血清:副结核阳性血清、牛型结核阳性血清、草分枝杆菌牛抗血清、堪萨斯分枝杆菌牛抗血清和偶发分枝杆菌牛抗血清经草分枝杆菌胞浆蛋白吸收处理前后与副结核菌P18株胞浆蛋白各组分抗体反应性的变化,以及副结核阳性血清经牛型结核菌全菌体、胞浆蛋白吸收处理前后抗体反应性的变化。其结果:草分枝杆菌胞浆蛋白的吸收处理可以在很大程度上消除或减弱因感染牛型结核菌、草分枝杆菌引起的交叉反应,而对消除或减弱偶发分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌的交叉反应的作用不理想,吸收前后,对副结核菌的抗体反应影响不大。与副结核菌有交叉反应的牛型结核菌抗原既存在于菌体表面,也存在于胞浆中,与25.4KD副结核菌胞浆蛋白分子有交叉反应的牛型结核菌抗原存在于胞浆中,24.6KD副结核菌胞浆蛋白抗原是副结核菌的特异性抗原。     

鸡朊蛋白的原核表达及其抗血清的制备

运用分子生物学方法分别构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达载体,经转化大肠杆菌BL21(DE3)和IPTG诱导表达,并对融合蛋白诱导表达时间、IPTG浓度进行优化,诱导表达的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白经GST-trap FF柱亲和层析纯化,用纯化后的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白免疫新西兰雄兔,以探究鸡朊蛋白的结构与功能。结果表明,本试验成功构建了pGEX-4T-ChPrP1、pGEX-4T-ChPrP2、pGEX-4T-ChPrP3重组表达菌,SDS-PAGE分析结果显示,得到大小为50、42和32ku左右的融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)、GST-ChPrP(174～247),与预期结果基本相符,在最适条件下每升pGEX-4T-ChPrP1菌液通过GST-trap FF层析柱获得的GST-ChPrP(25～247)融合蛋白达10mg,制备的抗血清经琼脂糖凝胶扩散试验检测到较高的多克隆抗体效价(1∶32);Western-blot分析结果显示,融合蛋白GST-ChPrP(25～247)、GST-ChPrP(96～247)和GST-ChPrP(174～247)及鸡脑组织蛋白均可与该抗血清发生特异性免疫反应。证实,鸡重组朊蛋白具有良好的抗原性,与鸡脑组织朊蛋白具有相同的抗原成分。     

猪带绦虫Ddi1-like蛋白的真核表达及其抗血清的制备

为了对DNA损伤诱导蛋白1(Ddi1-like)基因功能进行研究,本研究参考GeneDB中猪带绦虫基因组注释信息,通过设计5′和3′端特异性引物,利用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得全长cDNA,并在毕赤酵母GS115中进行诱导表达;将纯化后的Ddi1-like重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗血清。结果,成功利用RACE获得Ddi1-like基因的全长cDNA序列;在真核表达系统中,绦虫上的Ddi1-like重组蛋白获得表达;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,获得重组蛋白即为Ddi1-like蛋白;免疫后获得抗血清,其效价达到1∶12 800。上述结果为后续研究Ddi1-like蛋白的酶切活性研究提供了基础。     

重组狮头鹅α干扰素的制备及其抗病毒活性

用PCR方法扩增了狮头鹅α干扰素(IFN-α)成熟肽编码序列,并克隆至pET-32a(+)表达载体,将重组质粒转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞并用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot检测结果表明,重组狮头鹅IFN-α融合蛋白(rGoIFN-α)的分子质量大小约36ku,能与IFN-α抗血清发生特异性结合反应。rGoIFN-α包涵体经过变性、超滤纯化和复性,得到可溶性rGoIFN-α。rGoIFN-α经肠激酶酶切(eGoIFN-α)、亲和纯化获得狮头鹅α干扰素蛋白(GoIFN-α)。rGoIFN-α经Western-blot检测证实是GoIFN-α蛋白。采用微量细胞病变抑制法分析α干扰素的抗病毒活性,复性后纯化的rGoIFN-α的抗病毒活性达1.42×104U/mg;eGoIFN-α的抗病毒活性达8.23×104U/mg,GoIFN-α抗病毒活性达3.34×105U/mg。结果表明,rGoIFN-α能够抑制新城疫病毒Roakin株在鸡胚成纤维细胞中复制。     

临床分离动物源性大肠杆菌周浆蛋白AcrA表达水平的测定

为研究大肠杆菌周浆蛋白AcrA表达水平与不同动物源性大肠杆菌多重耐药水平之间的关系,将获得的重组阳性质粒pET28a(+)-acrA转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,经IPTG诱导表达,得到约42ku的目的蛋白。AcrA蛋白表达产物经侧带法纯化后免疫獭兔,制备抗AcrA的多克隆抗体,采用间接ELISA法检测临床分离的31株不同动物源性大肠杆菌中acrA基因的表达水平。结果显示,随着多数被检大肠杆菌多重耐药水平的提高,AcrA蛋白的表达量有上调的趋势。表明,动物源性大肠杆菌的多重耐药水平与AcrA蛋白的表达水平可能存在相关性。     

狂犬病“靶向性”Th表位DNA疫苗的构建与瞬时表达研究

用RT-PCR扩增BALB/c小鼠P31基因,在不影响氨基酸序列前提下,对序列中461nt NcoⅠ酶切位点进行定点突变;采用定向克隆方法将狂犬病病毒核蛋白、糖蛋白及NS蛋白主要Th抗原表位核苷酸序列替换P31序列中CLIP区域,进行新一轮PCR反应获得带有Kozak调控序列的P31-Th分子,以增加目的基因的表达量,并将含有Kozak序列的P31-Th分子克隆入真核表达载体pCI-neo多克隆位点,通过PCR与限制性内切酶酶切方法进行鉴定;最后将各Th表位表达载体转染COS-7细胞,Western-blot检测目的基因的瞬时表达。测序分析结果表明,BALB/c小鼠P31基因CDS区长648bp,编码215个氨基酸,与Gen-Bank中登录的Ii分子（NM₀10545）的核苷酸序列、氨基酸序列均存在多个位点差异;定点突变后获得了P31分子突变体,经PCR及限制性内切酶酶切方法证明,成功构建了携带P31-Th分子的真核表达载体;Western-blot分析证实,各P31-Th分子均在COS-7细胞中获得瞬时表达,且表达的目的产物能够与兔抗P31多克隆抗体发生抗原抗体结合反应。结果表明,作者成功构建了狂犬病病毒主要Th抗原表位的"靶向性"核酸疫苗,为开展在小鼠的免疫学试验奠定了基础。     

信号肽对O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中表达及分泌的影响

构建融合不同信号肽的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白真核表达载体,筛选不同的分泌型信号肽以提高O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)中的表达并使其分泌到CHO培养基中。通过PCR方法将10种不同的分泌型信号肽与串联表位基因的5′端相连,分别构建了真核表达载体并转染哺乳动物细胞CHO,采用Western-blot检测CHO培养基中重组表位蛋白累积量,研究结果表明,O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中成功分泌表达,不同的分泌型信号肽明显改变O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO培养基中的累积SCGB1D1 isoform信号肽介导的O型口蹄疫病毒重组表位蛋白表达量最高。综上所述,合适的分泌型信号肽促进O型口蹄疫病毒重组表位蛋白在CHO中的分泌。     

埃博拉病毒苏丹型核蛋白的原核表达及纯化

将目的基因NP亚克隆入原核表达质粒pET-28(a)中,构建了重组表达载体pET-28(a)-S-NP,然后用重组质粒转化BL21(DE3)感受态细菌,并利用IPTG诱导蛋白表达。将表达的蛋白利用His-Band Ni+柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果显示,重组质粒经双酶切后可得到与目的片段长度相同的特异性条带;测序结果显示此特异性条带与参考序列完全匹配,没有突变。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,表达正确。结果表明,成功构建了重组表达质粒,且表达产物正确。     

寨卡病毒NS1蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

本研究旨在采用杆状病毒表达系统表达并纯化寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)NS1蛋白,并对其免疫原性进行鉴定。将ZIKV NS1基因克隆至杆状病毒载体pFastBac1中,构建重组转移载体,将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒,经SDSPAGE和Western-blot鉴定蛋白正确表达后,将其感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,将纯化后的ZIKV NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,进行血清特异性抗体效价检测。最终结果显示,获得了纯度较高分泌表达的ZIKV NS1蛋白,并且血清特异性抗体效价实验表明,纯化的ZIKV NS1蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,有很好的免疫原性。本研究为ZIKV疫苗和诊断试剂盒的研发奠定了重要的基础。     

牛结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的原核表达及其在牛结核病检测中的应用

采用重组PCR技术从牛结核分枝杆菌AN5基因组DNA中扩增CFP10-ESAT6融合基因,并将其定向克隆至原核表达载体pET-32a,构建了原核表达质粒pET-CFP10/ESAT6.重组子经酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳鉴定,获得约42 ku带有6×His蛋白标签的rHIS-CFP10/ESAT6融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的40%.用HIS蛋白纯化柱纯化该蛋白,Western-blot分析显示,该融合蛋白能与抗牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应.将重组的该融合蛋白用于刺激单次皮内变态反应阳性牛全血,可以产生高水平的IFN-γ,其特异性优于结核菌素.结果表明,获得的重组融合蛋白rHIS-CFP10/ESAT6为牛结核病的诊断奠定了基础.     

伯氏疏螺旋体外膜蛋白C的表达及抗原性分析

以伯氏疏螺旋体SZ(B.garinii)、BO23(B.afzelii)、B31(B.burgdorferi sensu stricto)菌株的外膜蛋白OspC基因为靶基因,将PCR扩增出的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中构建重组质粒进行表达,表达的蛋白用MagneGSTTMProtein Purification System纯化,之后用此3株菌株免疫羊制备的阳性血清做Western-blot,检测该重组蛋白。证明这3个基因型菌株的重组OspC具有抗原性及交叉反应性。本研究表达的重组蛋白OspC(SZ菌株)为建立羊体内伯氏疏螺旋体抗体的ELISA检测方法奠定了基础。     

结核分枝杆菌pdhA基因的原核表达及其免疫原性分析

以结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出1 100bp的pdhA(pyruvate dehydrogenase E1component alpha subunit)基因,经限制性酶切后,与pET-28a载体连接,转化到大肠杆菌BL21中,重组菌经1mmol/L IPTG诱导表达了pdhA蛋白,并用Ni-His-resin纯化了目的蛋白,经Western-blot分析鉴定了目的蛋白的免疫原性。结果显示,重组质粒的双酶切鉴定和DNA测序均正确;SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在44ku处获得一目的条带,且具有很好的免疫原性。本研究成功获得了高纯度的重组蛋白pdhA,为深入研究其功能奠定了基础。     

多头带绦虫六钩蚴Tm45W基因的克隆表达与免疫原性分析

为分析多头带绦虫Tm45W重组蛋白的免疫原性,利用RT-PCR技术首次从激活的多头带绦虫六钩蚴中扩增出多头带绦虫Tm45W基因。将扩增产物重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建pET32a-Tm45W表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白;表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析后,将纯化的Tm45W重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其血清抗体。结果显示,Tm45W基因全长为813bp,其开放阅读框为765bp,编码255个氨基酸,与多头带绦虫新疆株多头蚴45m基因(序列号:EU326106)的部分序列同源性为90.60%;表达的重组蛋白大小为45ku,与脑多头蚴病羊血清的免疫印迹分析呈阳性反应;小鼠免疫后第1周血清中即可检测到抗Tm45W蛋白的特异性抗体,并于免疫后第35天达到高峰。结果表明Tm45W重组蛋白具有较好的反应活性,能引起机体较强的体液免疫反应。     

猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析

为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。