牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种能够快速、简便地检测牛、羊赤羽病病毒的分子生物学方法,根据赤羽病病毒特异性S基因的6个特异区域设计了2对引物,首次建立了赤羽病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法,对LAMP反应条件进行了优化,并将其与普通PCR方法进行比较。结果显示,LAMP检测方法的特异性好,只对赤羽病病毒进行扩增,且操作简便。本研究确定的最佳反应温度为63℃,核酸检测的最低检出限为1.08ng/μL,比普通PCR的灵敏度高2个数量级。该方法为赤羽病病毒的一种最新的快速、简便的检测方法,可用于出入境牛、羊赤羽病的快速检测。     

羊传染性脓疱病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

针对羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因序列设计合成了1对引物,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测ORFV核酸的SYBRGreenⅠreal-timePCR方法。结果显示,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数为0.999;检测灵敏度可达9.4×104copies/μL;与绵羊痘病毒(SPV)不发生交叉反应,具有良好的特异性;组内Ct值相同,组间变异系数小于2%。应用建立的方法检测20份疑似羊传染性脓疱病病料,结果17份为阳性,同时用常规PCR进行检测,结果仅10份为阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可初步用于ORFV的检测。     

传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的建立及其应用

为建立一种用于快速检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的逆转录环介导等温扩增技术(RTLAMP)方法,设计了针对VP1基因保守序列的5组引物,采用荧光检测试剂通过实时浊度仪监测阳性扩增结果。结果显示,从5组引物中筛选出了1组对IBDV有效扩增的引物,利用该引物能够在63℃、1 h条件下实现IBDV VP1基因片段的特异性扩增,与其他病毒的核酸无扩增反应;样品RNA的最低检出量为5×10-5ng/L;利用建立的检测方法对14份临床样品进行检测,其阳性检出率为100%。结果表明,建立的IBDV RT-LAMP检测方法具有快速、准确、特异性强、灵敏度高和便捷的特点,可用于IBD临床样品的检测。     

山羊痘病毒及口疮病毒ITR-059基因双重PCR检测方法的建立

为实现山羊痘病毒(GTPV)和口疮病毒(ORFV)的同步快速检测,基于GTPV的ITR基因及ORFV的059基因,分别设计用于普通双重PCR的引物2对、用于二联实时荧光定量PCR的特异性引物及探针2套;探针分别用5′JOE-Eclipse3′及5′FAM-TAMRA3′荧光染料标记物进行标记。结果显示,所建立的GTPV-ITR-L-ORFV-059双重普通PCR方法,可实现对GTPV与ORFV的特异性双重检测,检测敏感度可达10~4copies/μL DNA;所建立的ITR-059二联探针实时荧光定量PCR方法可同时特异性检测ORFV和GTPV产生特异性荧光信号,二联探针的检测敏感度可分别达10~(2.87)和10~(2.52) copies/μL DNA。本研究初步建立了可同步特异性检测GTPV和ORFV的双重普通PCR及二联探针实时荧光定量PCR检测方法。     

内蒙古绵羊梅迪-维斯纳病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种检测内蒙古地区绵羊梅迪-维斯纳病毒(MVV)的TaqMan荧光定量PCR方法,根据高度保守的gag基因序列设计特异性引物和探针,通过对反应条件和反应体系的优化,建立了快速检测MVV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果显示,扩增相关系数为0.999,对重组标准质粒的最低检测量为1.0×10~0 copies/μL,对羊的其他肺炎表现常见病原核酸无扩增反应;利用该方法对内蒙古地区12份疑似病例的肺组织进行检测,其中3份为MVV阳性。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法在MVV的快速、准确诊断中具有良好的应用前景,也将为内蒙古地区防控梅迪-维斯纳病提供可靠的检测手段。     

鸡细小病毒荧光LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种可鉴别鸡细小病毒(ChPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。根据鸡细小病毒NS1基因的保守序列,设计了1套特异性引物,在该套引物的F3与B3区域中设计1个探针,其探针用FAM标记,优化建立了能鉴别ChPV的荧光LAMP检测方法,并使用所建立的方法对21份临床样品进行检测。结果显示,该方法特异性好,能检测到ChPV,并与其他禽类病毒无交叉反应;灵敏度高,最低能够检测1.02×10^-5ng/μL的ChPV DNA模板;对临床可疑样品的检出率为24%。表明,本研究建立的ChPV荧光LAMP方法具有简便快速、特异性好、敏感性高等优点,可用于检测ChPV。     

猪伪狂犬病病毒野毒株与疫苗株荧光定量PCR检测方法的建立和应用

根据伪狂犬病病毒gD、gE基因序列设计2对引物及其对应的探针,通过对引物、探针浓度的优化,建立了猪伪狂犬病病毒野毒和减毒活疫苗株荧光定量PCR检测鉴别方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果显示,猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪博卡病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无扩增曲线。野毒株均出现gD和gE基因扩增曲线,而疫苗株只出现了gD基因扩增曲线,表明该检测方法具有良好的特异性。建立的gD和gE基因标准曲线Ct值和模板终浓度在1×108～1×10 copies/μL范围内均具有良好的线性关系,灵敏度均可达1×10 copies/μL。对39份猪组织样品进行检测,荧光定量PCR检出5份样品猪伪狂犬病病毒gD、gE阳性,表明这5份猪组织样品为猪伪狂犬病病毒野毒感染。常规PCR检出5份猪伪狂犬病病毒阳性,经测序为野毒感染,2种方法符合率为100%。本研究建立的荧光定量PCR可用于猪伪狂犬病病毒的快速检测和流行病学调查。     

应用PCR检测山羊痘病毒

初步建立了用于诊断山羊皮肤组织中山羊痘病毒的PCR方法。试验设计了 2对引物 ,用以分别检测山羊痘病毒的特异性基因和α 微管蛋白基因。克隆到的DNA扩增产物的序列与GenBank中收录的序列同源性达到 98%。试验表明 ,用PCR方法可快速检测样品中的山羊痘病毒。     

山羊支原体山羊肺炎亚种TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立和应用

为了快速诊断和定量检测山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp),选择Mccp arc D基因为靶序列,设计特异性引物和探针,建立并优化反应体系,以Mccp和其他支原体及细菌等16种病原体基因组DNA为模板,进行普通PCR和TaqMan探针实时荧光定量PCR特异性检测,并对该方法的敏感性和重复性进行评估。同时利用该方法对68份山羊临床样本进行检测。结果显示,仅Mccp有扩增条带(185 bp)和明显的荧光扩增信号(Ct值为21.93),其余供试菌株没有扩增条带,且表现出微弱的荧光扩增信号(Ct值均大于31)。普通PCR检测的灵敏度为5.96×104copies/L,而TaqMan探针实时荧光定量PCR检测的灵敏度为5.96 copies/L。Ct值在组内和组间重复的变异系数均小于1%。对68份山羊临床样本进行TaqMan探针实时荧光定量PCR检测,结果有2份为Mccp阳性样本,阳性率为2.94%。本研究建立了一种特异、敏感、稳定可靠的Mccp TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,可用于Mccp的快速诊断和定量检测,为山羊传染性胸膜肺炎的防控提供了有效的技术手段。     

鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为鼠源VCAM-1基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测鼠源VCAM-1基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.998;灵敏性、重复性及特异性均较高。可用于鼠源细胞中VCAM-1基因的定性鉴别和含量测定。结果表明,成功建立了一种快速准确检测鼠源VCAM-1基因的TaqMan实时荧光定量PCR法。     

湖北省禽白血病自然病例的病理学诊断及p53和Bcl-2基因表达情况的观察

应用组织病理学和SABC免疫组织化学技术,对湖北省武汉市的2批14日龄和33日龄疑似禽白血病肉鸡进行了病理学诊断,并观察了病鸡肝肿瘤组织中p53基因和Bcl-2基因的表达情况。剖检可见病鸡肝、肾、脾均不同程度肿胀,组织病理学检查在肝、肾、心等脏器可见散在或聚集成团的骨髓瘤细胞,胞浆内充满球形的嗜酸性颗粒;在病鸡肝肿瘤组织中p53和Bcl-2基因均呈阳性表达,诊断为J亚群禽白血病(ALV-J),提示p53基因和Bcl-2基因与肉鸡J亚群禽白血病有关。     

鸡传染性支气管炎病毒中国分离株S1基因的序列分析

采用RTPCR方法扩增了12株鸡传染性支气管炎病毒中国分离株的全长S1基因,并进行了序列分析。通过与GenBank中登录的其他IBV参考毒株S1基因序列比较,进行了系统进化分析。结果表明,12株分离毒株属于同一个进化群的2个不同进化亚群。其中11株分离株与国内一些分离株亲缘关系最近,属于同一进化亚群,而广西分离株GX041则与欧洲毒株4/91亲缘关系较近,属于另一亚群。这些结果说明,中国各地的流行毒株变异较大,实际免疫中要根据流行毒株的特性选择合适的疫苗株来进行。     

犬新孢子虫不同靶基因PCR检测方法的比较

为筛选出检测犬新孢子虫更为特异、敏感的PCR方法,分别以MAG1、SAG1和Nc5为靶基因进行PCR检测,并从敏感性、特异性和临床样本检出率等方面进行了比较。结果显示,以Nc5为靶基因的PCR方法敏感性最高,最小检测DNA量为17.8fg/μL;以MAG1为靶基因的PCR方法敏感性最低,最小检测DNA量为17.8pg/μL;而以SAG1为靶基因的PCR方法的最低检测量为178fg/μL;3种靶基因引物均扩增不出刚地弓形虫、牛瑟氏泰勒虫、猪附红细胞体等基因片段,具有较好的特异性;对28份已攻犬新孢子虫标准株的BALB/c小鼠组织样本的检测结果表明,以Nc5基因设计的引物检出率最高,为75.0%(21/28),明显高于SAG1基因的67.9%(19/28)和MAG1基因的53.6%(15/28)。本试验为新孢子虫病的诊断及流行病学调查提供了更为敏感、特异的检测技术。     

检测987p+肠毒素性大肠埃希氏菌PCR方法的建立

以 98 7p菌毛结构基因保守序列为靶序列 ,设计合成了 1对可扩增 45 9bp目的片段的引物 ,建立了检测肠毒素性大肠埃希氏菌 987p菌毛基因的PCR方法。该方法对K 88 ( 为菌毛阳性 )、K 99 、F 41 参考菌株和链球菌、葡萄球菌、巴氏杆菌的检测结果均为阴性 ;该方法的敏感度可达 10 2 CFU ,对 2 0株腹泻仔猪粪便分离物进行检测 ,有 1株为阳性 ,与血清学检测的结果一致。结果表明 ,此方法特异性和敏感性都很高 ,可用于临床 987p肠毒素性大肠埃希氏菌病的快速诊断和流行病学调查     

炭疽杆菌基因检测技术的研究进展

从炭疽杆菌基因组组成、炭疽杆菌基因组的特征及其在基因检测中的应用几方面阐述了炭疽杆菌基因检测技术的研究进展,探讨了分别位于pXO1和pXO2质粒上的主要致病毒素编码基因pagAl、ef、cya和参与荚膜合成的主要蛋白编码基因capA、capB和capC的作用,认为这些炭疽杆菌特异基因序列是建立基因检测体系的可靠基础,其标志性序列有早期发现的序列指纹图谱、高度保守基因序列和最新发现的高度特异基因序列,基因检测方法从早期的RFLP、VNTR、单重PCR、多重PCR发展到最新的实时定量PCR,随着标志性序列特异性的增加和检测方法的改进,炭疽杆菌的诊断工作变得更加准确和快捷。     

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC)。人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g。样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100~5.8×100CFU/mL(或CFU/g)。试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染。     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

食品中沙门氏菌DNA环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据沙门氏菌属高度保守的fimY基因序列设计了2对特异性引物,采用环介导等温扩增方法(LAMP)建立了食品中沙门氏菌的LAMP快速检测方法。结果表明,建立的LAMP方法具有高度特异性,经对40种共68株细菌进行扩增,所试32株沙门氏菌均为LAMP阳性,其他菌株为LAMP阴性。建立的LAMP方法对培养的沙门氏菌的检测灵敏度为5CFU/管,对污染食品中沙门氏菌的检测灵敏度为9CFU/管,60min内即可完成检测。用建立的LAMP方法对802份肉类、蛋、奶及其制品和动物腹泻物、人工污染样品等进行检测,共检出165份LAMP阳性样本,与国标(GB/T4789.4-2008)方法的检测结果一致。建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

肾型传染性支气管炎病毒的鉴定和结构蛋白的表达

对分离自江苏省某发病蛋鸡群中1株病毒(Ck/Jiangsu/DS10/2008,DS10)进行了生物学特性鉴定。同时利用RT-PCR扩增该病毒的S基因、M基因和E基因并进行测序,与GenBank中其他参考株构建进化树,进行比对分析,研究其遗传进化关系。另将S基因、M基因和E基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac 1载体并转染Sf9细胞进行表达,用间接免疫荧光鉴定其表达,用琼扩试验验证表达产物的反应性。经生物学特性鉴定,DS10病毒为嗜肾型传染性支气管炎病毒(IBV)。遗传进化分析表明,各基因之间的遗传进化关系无明显相关性。间接免疫荧光检测表明,S蛋白、M蛋白和E蛋白在Sf9细胞中得到表达。琼扩试验证实,S基因和M基因的表达产物具有良好的反应性,而E蛋白未发现与阳性血清反应所产生的特异沉淀线,表明所表达的S蛋白和M蛋白具有良好的生物学活性,E蛋白可能因其自身分子质量小,在病毒中的含量较少相关。研究结果提示,现有传染性支气管炎疫苗对流行株保护效果不佳,表达的S蛋白、M     

MDCK细胞感染犬细小病毒后的差异表达谱分析

通过了解MDCK细胞感染犬细小病毒(CPV)后基因表达水平的差异,研究病毒对细胞的致病作用以及细胞抵御病毒感染的机制。利用表达谱基因芯片技术,分析持续感染犬细小病毒的MDCK细胞基因表达水平的变化情况,并用Real-Time PCR技术加以验证。结果显示,获得了359个差异大于1.5倍的表达基因(P0.05),占总基因数的1.53%,其中193个上调表达(0.84%),166个下调表达(0.69%)。对差异基因进行GO功能聚类分析,小部分涉及免疫应答、生长周期调控、信号转导和蛋白酶活性,其他大部分基因功能未知。利用Real-Time PCR随机验证5个基因在持续感染CPV后的差异表达,其结果和芯片杂交的结果一致。表明建立了MDCK细胞持续感染CPV后的差异表达谱,初步了解到CPV对宿主细胞的制约作用,引起部分细胞增殖调控相关基因发生了表达下调,以及细胞对感染的积极应答反应,部分免疫反应基因、肽链内切酶活性基因等发生了上调表达,从而为探索病毒的致病机理和宿主的抗病毒途径提供了试验基础。