免疫鼠血清中曼氏血吸虫抗原特异性的独特型抗体的检测

本实验证实了三株曼氏血吸虫抗原特异性的单抗各识别一个特异的抗原表位。采用ELISA竞争法显示了辐照致弱尾蚴免疫鼠和正常尾蚴免疫鼠血清中保护性单抗D_6的含量与尾蚴抗原特异性的总IgG水平相关,而非保护性单抗N_(122)则无关。两种免疫鼠血清中血吸虫尾蚴抗原特异性的总IgG水平变化不一致,但从免疫后第1至第6周,两种免疫鼠血清中保护性单抗D_6的含量却很接近。本实验的结果从克隆水平说明体液免疫应答在血吸虫病的免疫抗性中起着一定的作用,同时也为解释辐照尾蚴免疫鼠模型的免疫机理提供一些有关体液免疫方面的实验依据。     

超声裂解日本血吸虫尾蚴粗抗原免疫啮齿类动物研究

本文采用Horowitz等(1982)的方法,用超声裂解的日本血吸虫尾蚴粗抗原结合佐剂氢氧化铝凝胶免疫6～8周龄的雌性Wistar大鼠、7周龄的雄性C_(57)BL/6小鼠和2kg重的雄性新西兰兔子。大鼠分为0.2、2、4和8μg四个免疫剂量组;小鼠分为0.2、2和4μg三个剂量组。大鼠和小鼠的免疫途径都是腹腔注射,在初次免疫后的第30天和第70天各加强免疫一次。兔子分为1μg和10μg两个剂量组,采用腘淋巴结免疫法,并在初次免疫后的第二周和第四周各加强免疫一次。所有动物在最后一次免疫后的第15天采用盖玻片法攻击感染日本血吸虫尾蚴。大鼠的攻击感染尾蚴数为500条,小鼠为60条,兔子为200条。攻击感染后第30天扑杀动物,用主动脉灌注法回收成虫,并以减虫率表示免疫保护力。试验结果表明,三种免疫动物均获得部份保护力。大鼠、小鼠和兔子的减虫率分别为33.82～45.14％、23.74～42.55％和16.57～19.92％。经统计学显著性测定,大鼠各组差异十分显著(P<0.01),小鼠和兔部份组差异显著。本文还应用被动皮肤过敏反应(PCA)检测试验动物IgE抗体的变化。结果发现活尾蚴免疫组除个别鼠外,均出观阳性反应,第一、二、三次免疫后的血清抗体滴度分别为1:4、1:8、和1:16,但超声裂解尾蚴抗原免疫组和对照组大鼠均为阴性。本试验说明在Wistar大鼠及     

三联抗原酶免疫试验诊断血吸虫病的方法简介

近年来,在血吸虫病研究中,我们设计了一种由尾蚴、成虫及虫卵三者切片组成的联合抗原酶免疫染色法,兹简介如下。(一)材料和方法1.成虫—虫卵—尾蚴三联抗原切片的制备:(1)组织块制备:①用1500条日本血吸虫尾蚴感染家兔,45天后剖杀取肝脏,将其剪成约0.5cm~3的小块,用生理盐水洗净。②取一正常小鼠心脏,用手术刀剖开,在心脏片中划数条槽;将感染家兔时预留的(固定或未固定)尾蚴约50条用滴管滴在心脏内包裹,再用线捆扎。③另取一正常小鼠心脏,用同样方法剖开,内放3～5条血吸虫成虫包裹捆扎。     

日本血吸虫抱雌沟蛋白DNA疫苗的研究

为构建含日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)完整ORF的核酸疫苗,评估该核酸疫苗在小鼠体内诱导抗血吸虫感染的免疫保护效果及其保护机制,将编码日本血吸虫大陆株抱雌沟蛋白基因ORF片段克隆到真核表达载体pVAX1中,用重组质粒pVAX1-SjGCP三次肌肉注射BALB/c小鼠,攻击感染血吸虫尾蚴,攻击感染后第42天剖杀小鼠冲虫,计算减虫率及肝和粪便的减卵率,评估其免疫保护效果。用流式细胞术(FCM)检测第3次免疫后小鼠淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占总淋巴细胞的百分比及细胞因子IL-4、IFN-γ表达水平,探讨核酸疫苗的免疫机制。结果显示,小鼠经pVAX1-SjGCP质粒免疫后诱导了31.9%的减虫率,以及47.85%、68.04%的肝减卵率和粪便减卵率,与PBS组差异显著;pVAX1-SjGCP免疫组淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比增加,细胞因子IFN-γ及特异性IgG水平提高,与pVAX1组差异显著。结果表明,血吸虫抱雌沟蛋白基因DNA疫苗能够诱导宿主细胞免疫和体液免疫应答,产生Th1/Th2型混合的细胞免疫反应,具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

日本血吸虫重组多表位核酸疫苗的构建与免疫保护效果评估

为构建重组日本血吸虫多表位核酸疫苗,并通过小鼠免疫保护试验比较不同重组多表位疫苗诱导的免疫保护效果,筛选并以PCR方法扩增日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)、谷胱甘肽-S-转移酶(Sj28GST)的抗原表位和23ku膜抗原大亲水区(LHD-Sj23)的编码DNA片段,构建了pCMV-LHD-Sj23-BSj28,pCMV-BGCP-LHD-Sj23,pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28三种日本血吸虫多表位核酸疫苗;采用肌肉注射法接种昆明系小鼠;用日本血吸虫尾蚴攻击感染后,剖杀小鼠,计算减虫率。结果显示,3种重组的真核表达质粒在免疫小鼠中分别获得了6.30%,14.76%和64.95%的减虫率。表明该重组多表位核酸疫苗可诱导较高的免疫保护效果,获得的三价核酸疫苗pCMV-BGCP-LHD-Sj23-BSj28具有潜在的应用价值。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白的单抗制备及抗原表位鉴定

用猪瘟病毒石门株E2(SM-E2)的BC区原核表达蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单抗,测定其效价并鉴定抗原表位。结果表明,制备了1株持续、稳定分泌抗SM-E2的单克隆抗体2B10,效价在1∶600～1∶1 000之间。单抗2B10能与常规SDS-PAGE转膜的SM-E2蛋白发生反应,表明其识别的是线性表位,并且该单抗只能识别石门毒株,而不能与C株疫苗及2型流行毒株发生反应。点突变E2蛋白ELISA分析结果表明,该单抗不与707、709、711、713和714位突变蛋白发生反应,表明单抗2B10识别的线性表位为707I-X-P-X-G-X-G-G714。该单抗对猪瘟病毒抗原多样性分析和致病机制研究有一定的应用价值。     

兔出血症病毒单克隆抗体的制备及鉴定

为建立兔出血症病毒(RHDV)的检测方法及为变异株监测做储备,用蔗糖密度梯度离心法纯化的RHDV免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行融合,以昆虫细胞一杆状病毒表达的重组VP60蛋白建立的间接ELISA法筛选抗RHDV单克隆抗体杂交瘤细胞,并对其主要生物学特性进行了鉴定.结果表明,筛选出6株单抗,它们分属于IgG1(AD4,AG10,DE2)、IgG2b(BC9,BE8)和IgM(BH3)亚类;这6株单抗杂交瘤细胞的平均染色体数为87～89条,将其冻存6个月后复苏,在体外传20代的过程中分泌的抗体效价变化不大,具有很好的稳定性;Western-blot及免疫荧光分析表明,单抗DE2、AG10识别线性表位,其余4株单抗识别构象型表位;竞争ELISA试验表明,这6株单抗可识别5种抗原表位.     

鹅源新城疫病毒单克隆抗体的研制及其与不同NDV毒株的反应性

以鹅源新城疫病毒(NDV)作为免疫原免疫BALB/c小鼠,获得了5 株具有HI特性的单克隆抗体,分别命名为2G5、3A4、3B5、6B1 和8C5,其腹水HI 效价分别为214、212、29、215 和28。竞争ELISA结果表明,2G5、3A4、3B5和6B1在HN蛋白上所针对的表位属于同一抗原区,而8C5针对的表位为另一抗原区。将上述5株单抗与不同来源的NDV进行了HI排谱试验。结果显示,同一抗原区4株单抗的反应谱比较一致,而与另一抗原区单抗8C5 的反应谱明显不同。5 株单抗与鹅源NDV毒株的反应性较强,而与鸽源NDV毒株的反应性较弱。这5 株单抗用HRP标记后再与不同单抗进行交叉夹心ELISA,得到了一个新的系统(2G5 8C5)。用该系统对NDV分离株做排谱试验。结果显示,该系统与鹅源NDV分离株的反应性较好,表明所建立的新系统可用于鹅源NDV的检测。     

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×105~1∶2×106;3株单抗都具有间接免疫荧光试验(IFA)和免疫印迹试验(Western-blotting)反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。     

猪源弓形虫的分离鉴定及基因型的研究

本研究的目的是分离鉴定江西省某猪场猪感染的弓形虫虫株并研究其多位点基因型。以江西省某猪场病死的后备母猪肺门淋巴结为材料,经触片、瑞氏染色,镜检可见弓形虫滋养体;将该阳性病料腹腔接种BALB/c小鼠,经连续传代分离得到弓形虫虫株(命名为TgPJX13),用基于B1基因的半巢式PCR方法对该分离虫株进行鉴定,得到弓形虫的特异条带。测序表明,TgPJX13株扩增片段序列与NCBI中的弓形虫B1基因序列完全一致。用PCR-RFLP方法在11个基因位点(其中SAG1、SAG2、SAG3、5′+3′SAG2、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358和PK1为核基因位点,Apico为顶质体基因位点)对TgPJX13虫株进行基因型鉴定,确定该虫株的基因型为ToxoDB#9。弓形虫TgPJX13株的成功分离和鉴定为进一步研究其毒力及生物学特性奠定了基础。     

日本血吸虫Sjzfp1基因的克隆表达及其表达产物的免疫效果

以PCR技术从日本血吸虫成虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆日本血吸虫锌指蛋白编码基因Sjzfp1以及181～786bp的DNA片段,分别以pGEX-4T和pET-28a(+)为表达载体制备重组抗原rSjzfp1/GST和rSjzfp1-1/His。将重组抗原与206佐剂混合后免疫小鼠,观察免疫预防效果。利用实时荧光定量PCR法检测Sjzfp1在不同发育期虫体中的表达情况。结果显示,获得了日本血吸虫Sjzfp1基因全长序列,其ORF为1017bp,编码338个氨基酸,推导的理论分子质量为38.5ku。生物信息学分析显示Sjzfp1为日本血吸虫环形锌指蛋白或PHD型锌指蛋白。以rSjzfp1/GST和rSjzfp1-1/His免疫小鼠,诱导的减虫率分别为50.43%和17.85%,肝虫卵减少率分别为72.64%和15.96%。实时荧光定量PCR分析表明Sjzfp1基因在各发育期虫体中均有表达,其中在尾蚴和毛蚴中表达量较高,在终末宿主体内各发育期虫体中,以42d成虫表达量最高。结果表明,Sjzfp1基因在抗血吸虫疫苗研究中具有进一步研究的潜力。     

抗弓形虫MIC3单抗的制备及其在速殖子免疫荧光观察中的应用

为开展弓形虫速殖子阶段蛋白表达和定位的相关研究,利用弓形虫重组微线体蛋白3(MIC3)抗原研制单克隆抗体,筛选出适合在虫体内用免疫荧光观察该蛋白的单抗分泌株,建立了弓形虫间接免疫荧光观察方法。结果显示,经4轮亚克隆后得到3株稳定分泌抗MIC3单抗的分泌株:4G1、1G12和5D7;经测定,3株MIC3单抗4G1、1G12和5D7的亚型分别为IgG1、IgG2b、IgG2b,效价分别为1∶3 200、1∶12 800、1∶1 600。筛选得到的2株MIC3单抗(4G1和1G12)可用于间接免疫荧光检测MIC3蛋白在虫体中的分布。通过弓形虫阳性感染猪血液样品推片的免疫荧光试验,验证了这3株单抗具有特异性。结果表明,研制的MIC3单抗和虫体荧光观察体系可用于速殖子MIC3蛋白在虫体表达定位和其他研究,也可作为其他速殖子抗原荧光观察的比较对象。     

猪肺炎霉形体热休克蛋白Hsp70单克隆抗体的制备及鉴定

以肺炎霉体体(Mhp)Yin-1株为模板,利用所合成的引物扩增了伴侣蛋白DnaK(热休克蛋白Hsp70)C末端基因,将得到的目的片段分别克隆至表达载体pET-28a和pGEX-6P-1中,原核表达获得了重组蛋白6P-1-DnakC和28a-DnakC,经Western-blot分析,均能被Mhp抗血清识别.以28a-DnakC作为包被抗原,建立了间接ELISA检测方法,以6P-1-DnakC为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠.筛选和鉴定了2株分泌抗DnaK的杂交瘤细胞株,命名为1AD10、2AF11.Western-blotting结果表明,这2株单抗与Mhp发生特异性反应而不与其他相关霉形体发生反应.抗体亚类鉴定结果显示,1AD10、2AF111分别为IgG2b和IgG2a亚类,且轻链均为κ链.相加ELISA试验表明,2株单抗能识别不同的抗原表位.     

分泌抗伊氏锥虫单克隆抗体杂交瘤株的建立

本试验以DEAE纤维柱层析法从感染小鼠血液中分离得纯净锥虫,再通过超声乳化,制备锥虫可溶性抗原,用其免疫BALB/c小鼠,再以此BALB/c小鼠脾细胞与SP_2/o骨髓瘤细胞融合,采用Dot-ELISA和间接ELISA法筛选出7株分泌针对伊氏锥虫的单克隆抗体的杂交瘤株(IH_(10)、AE_7、EB_6、BE_5、AG_(11)、BA_5、GB_6),实验结果表明,间接ELISA和Dot-ELISA符合率良好。分泌的7种克隆抗体有5株属于IgG_1,2株属于IgG_(2a);用阴性血清封闭试验及交互抑制试验证实7株单抗都是针对伊氏锥虫的,并证明是针对不同决定簇的。     

伏基弗治疗家兔实验感染日本血吸虫病

施福恢等曾应用伏基弗以10mg/kg剂量1次口服,治疗黄牛人工定量感染日本血吸虫,结果减虫率为76.3％,减雌率92.1％。为了进一步阐明伏基弗对日本血吸虫的作用,本文应用该药两种制剂,对家兔实验感染日本血吸虫进行了抗虫效果试验。 (一)材料与方法 1.动物:本所自繁的新西兰健康大白兔,体重1.5～2kg。 2.日本血吸虫尾蚴及实验感染:用本所培养的钉螺新逸出的尾蚴,以腹部盖片法感染家兔,每兔200±1条,感染40～45天后投药。 3.药物与剂量:伏基弗3.3％的口服混悬液,以50mg/kg剂量灌胃;5％注射剂,以30、40、50mg     

中国大陆株日本血吸虫23kD基因重组抗原的研究──23kD抗原大亲水区多肽基因重组抗原的制备及抗原性测定

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）技术从中国大陆株日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库筛选到一编码２３ｋＤ抗原大亲水区多肽的克隆基因，并把它连接到ｐＧＥＸ载体上进行ＤＮＡ序列分析和蛋白质表达。结果表明，该克隆基因和编码菲律宾株日本血吸虫２３ｋＤ抗原大亲水区多肽的克隆基因碱基组成非常相似，１９３个碱基中只有一个不同，而且这个碱基差异不影响氨基酸序列组成。该重组基因在大肠杆菌里得到高产量表达，而且融合蛋白的纯化很方便。免疫印渍转移试验表明，该融合蛋白能被慢性感染日本血吸虫的小鼠血清、辐照致弱日本血吸虫尾为免疫动物血清、日本血吸虫成虫膜抗原和血吸虫谷腕甘肽转移酶（ＧＳＴ）免疫小鼠血清所识别，具有较强的抗原性。     

猪脑心肌炎病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用纯化的猪脑心肌炎病毒(EMCV)VP1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,获得了2株稳定分泌抗EMCV VP1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为10B和11D。经ELISA测定,2株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1∶1 600和1∶800,接种小鼠的腹水效价分别为1∶2.56×106和1∶1.28×106。2株单抗的亚类均为IgG2a,均能特异性识别重组VP1蛋白,但它们识别VP1蛋白的不同表位。间接免疫荧光和免疫组织化学试验证实,2株单抗具有良好的特异性,均能够识别EMCV。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用重组杆状病毒表达的猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术,共获得6株能稳定分泌抗Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3H9/1H5、3H9/3C7、4A9/3E2、4A9/3D7、6G7/7B6和6G7/8D3,并通过ELISA、Western-blotting和间接免疫荧光试验(IFA)对6株单抗的特性和抗原表位进行分析鉴定。结果显示,6株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 024～1∶2 048,腹水效价为1∶163 840～1∶204 800。3H9/1H5、3H9/3C7、6G7/7B6和6G7/8D3的亚型为IgG1型,4A9/3E2和4A9/3D7为IgG2b型,所有单抗的轻链均为κ型。Western-blotting和IFA结果表明6株单抗均能与重组Cap蛋白和PCV2产生特异性反应。相加ELISA结果显示,6株单抗可能识别不同的抗原表位。为准确鉴别不同单抗针对的抗原位点,以截短表达的重组Cap蛋白为抗原,进行Western-blot鉴定。结果显示,4A9/3E2与4A9/3D7的抗原表位位于101～150aa,其余4株单抗可能针对1～50aa或者天然...     

2型猪链球菌动物致病性试验

用5株2型猪链球茵对BALB/c小鼠、猪、兔和普通小白鼠进行攻毒试验,其中SS2-1、SS2-H、SS2-006444、SS2-7株对BALB/c小鼠有致病性,其LD50分别为2.1×106、3.1×107、5.3×10 7、9.4×107,SS2-N株以2.8×108对BALB/c小鼠不致死.SS2-1株对猪有致病性,LD50为4.2×107,ID50为1.33×106,而以8×108活菌攻击对兔和普通小白鼠均未致病.表明2型猪链球茵可人工感染BALB/c小鼠和猪引起发病,2型猪链球菌MRP和EF毒力因子的表现型与其对BALB/c小鼠的致病性无相关关系,BALB/c小鼠可用作疫苗免疫试验的动物模型.     

小鼠抗日本血吸虫感染的脾早期细胞免疫应答的初步研究

以日本血吸虫尾蚴攻击感染C57BL/6小鼠,分别于感染后第1、2、3、4、5、7、9、11、13天收集小鼠脾组织,检测分析早期感染阶段小鼠脾中重要炎症因子的表达动态变化,观察脾不同亚群免疫细胞的变化趋势,分析先天免疫分子在血吸虫感染宿主免疫应答进程中的作用。RT-q PCR结果表明,GZMA、GZMB、GZMK等颗粒酶,CCL2、CXCL10、CXCL11等趋化因子,IL-12a、IL-4、IL-6、IL-10等白细胞介素在感染后均不同程度上调表达;流式细胞术结果表明,小鼠感染日本血吸虫后CD3~+CD4~+T细胞和CD3~+CD8~+T细胞比值一直高于未感染对照组;同时NK细胞亚群比例在感染后第5天和7天明显增多。这些免疫相关细胞和分子的变化可能在小鼠抗血吸虫感染中发挥了重要作用。本研究为探究日本血吸虫感染的先天免疫机制等积累了实验数据。