鸡IL-1β和IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立检测鸡IL-1β、IL-2及IL-6基因的荧光定量PCR方法,根据GenBank上IL-1β、IL-2、IL-6的基因序列,在保守区设计并合成了各自的特异引物,选择β-actin和GAPDH基因为内参,采用SYBRGreen Ⅰ染料法,以常规PCR产物为标准品,建立标准曲线,并进行熔解曲线分析.结果显示,各基因标准曲线的C_1值检测范围在12～33左右,具有良好的线性关系,r~2均大于0.990.熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰.结果表明,建立的鸡IL-1β、IL-2及IL-6基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,为从mRNA水平对鸡IL进行定量分析奠定了基础.     

牛共刺激分子CD80和CD86实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中牛CD80和CD86基因的序列,在保守区设计并合成各自的特异引物,并以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立一种检测牛共刺激分子CD80和CD86的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。将CD80基因和CD86基因克隆至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果表明,CD80基因、CD86基因和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×102～1×108 copies/μL范围均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好。证实,所建立的牛共刺激分子CD80和CD86荧光定量RT-PCR检测方法适用于临床样品的检测。     

猪IFN-γ mRNA TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测猪γ-干扰素(IFN-γ)的荧光定量RT-PCR方法,针对猪IFN-γ基因和管家基因cyclophilin A(CyPA)的核苷酸序列分别设计了特异性引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-IFN-γ和pMD18-T-CyPA为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建猪IFN一γ mRNA和CyPA的荧光定量RT-PCR标准曲线.结果表明,建立的方法在1×101～1×107copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,相关系数r2均高达0.999,扩增效率均高于99.0%;可检测至少为100 copies的阳性标准品.该方法具有快速、敏感性高、特异性强和重复性好等特点,可应用于临床样品的检测.     

山羊IFN-γ和TNF-α基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中山羊γ-干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的基因序列,设计特异引物扩增目的基因。将IFN-γ、TNF-α基因克隆至p MD-19-T载体,得到各自阳性克隆质粒,以2种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。应用所建立的方法检测刀豆蛋白A(Con A)刺激健康山羊外周血单核细胞(PBMC)后不同时间点IFN-γ、TNF-α基因转录量。结果表明,当质粒标准品稀释度为1×10~9copies/L~1×10~5copies/L时,扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.999和1.000;熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。IFN-γ在第2小时和第48小时这两个时间点出现mRNA转录高峰,在第2小时检测到IFN-γ转录量为1.26×10~5copies/L,第48小时检测到转录量为8.56×10~4copies/L;TNF-α在0~24 h呈现下调的表达趋势,第48小时出现mRNA转录高峰,转录量为2.73×10~5copies/L;研究结果将为IFN-γ、TNF-α的定量分析提供技术平台。     

鸡γ-干扰素实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种检测鸡γ-干扰素的实时荧光定量RT-PCR方法,采用RT-PCR方法从ConA诱导活化的鸡脾淋巴细胞的总RNA中扩增得到鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)和鸡的28 SrRNA(Ch28 S)基因,将其分别克隆至体外转录载体后经体外转录获得了ChIFN-γ和Ch28 S的RNA,采用各自的特异性引物及Taqman探针,以Ch28 S RNA作为内参进行一步法实时荧光定量RT-PCR,检测ChIFN-γ。结果表明:ChIFN-γ和内参Ch28 S的Ct值与标准品稀释梯度在1×102~1×107拷贝/μL范围分别呈良好的线性关系,r2均大于0.99。此方法用于检测ChIFN-γ,具有简便、高效、敏感、特异的特点。     

鸡Akt基因mRNA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为快速检测鸡细胞的增殖能力,利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术,建立鸡Akt基因mRNA的定量分析方法。根据GenBank中原鸡Akt基因和鸡β-actin基因序列,设计合成特异性引物,应用RT-PCR技术从DF-1细胞中扩增出目的基因的DNA片段,并将纯化后的PCR产物与pMD18-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,构建重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin。分别以重组质粒pMD18-Akt和pMD18-β-actin为标准品建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测的标准曲线。结果显示,建立的RT-PCR标准曲线具有良好的线性关系和特异的单个峰,能够对样品进行稳定可靠的定量检测。采用本方法检测DF-1-PrP和DF-1-count细胞系的Akt基因的相对表达量,前者为1.656 9×103,后者为2.257 4×102,DF-1-PrP细胞系的Akt基因表达量明显高于DF-1-cont细胞系(P0.01),说明PrPC及Akt在DF-1细胞系中的表达量呈正相关。结果表明,本研究建立的鸡Akt RT-PCR检测方法能够通过对Akt基因的转录量进行检测而评价鸡细胞的增殖能力。     

三种鸡细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡细胞因子SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中三种重要的鸡细胞因子即ChIL-12、ChIL-15、ChIL-18的基因序列,以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(ChGAPDH)基因为内参,设计特异引物扩增目的基因。将四种基因克隆至pMD18-T载体上,得到各自阳性克隆质粒,以四种阳性质粒为标准品建立标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验。结果显示,当标准品稀释度为1×102～1×1010 copies/μL时,四种基因的Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.985。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。应用建立的方法对堆型艾美耳球虫核酸疫苗pcDNA-Ea3-1E免疫的SPF雏鸡脾中ChIL-12mRNA和ChIL-18 mRNA的相对表达量进行检测,免疫组ChIL-12mRNA和ChIL-18mRNA的相对表达量均极显著高于空白对照组(P<0.01)。研究结果为ChIL-12、ChIL-15、ChIL-18的定量分析提供了技术平台。     

绵羊IFN-γ和IL-2基因SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法的建立及应用

为探讨传染性脓疱病毒感染后机体的细胞免疫应答,从分子水平对传染性脓疱病毒的免疫机制进行了深入探讨。首先针对Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2以及管家基因GAPDH的mRNA序列分别设计了1对特异性引物,扩增相应的基因片段并构建含有相应基因序列的重组质粒,以所构建的重组质粒作为阳性标准品,建立了用于IFN-γ、IL-2及GAPDH检测的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。该方法线性关系良好,IFN-γ、IL-2和GAPDH标准曲线的相关系数均达0.99以上;敏感性高,初始模板的检出下限均达1×103copies/μL;特异性强,扩增产物形成单一的特异性融解峰;重复性好,组内与组间的变异系数均小于3%。应用该方法对传染性脓疱病毒感染羔羊外周血白细胞中的IFN-γ、IL-2 mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,建立的real-time PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点,可用于绵羊Th1型细胞因子的检测及定量分析。     

鸡肠相关性淋巴组织中IFN-γ和IL-2 mRNA表达的动态变化

通过实时荧光定量PCR方法,检测鸡在胚胎时期和出壳后初期肠道相关性淋巴组织(GALT)中IFN-γ基因和IL-2基因mRNA的表达水平,从而了解鸡GALT免疫功能的建立情况并反映鸡在此阶段的免疫状态。结果显示,胚胎20日龄和出壳后1日龄各肠段GALT中均有少量IL-2mRNA和IFN-γmRNA的表达。盲肠扁桃体、直肠和食管扁桃体中IL-2基因的表达水平在出壳后4日龄时显著升高(P<0.05),而在7日龄时又略有下降。除食管扁桃体外,各肠段GALT中IFN-γmRNA的表达水平在4日龄时显著升高(P<0.05),而空肠、回肠和直肠中其表达水平在7日龄时又显著下降(P<0.05)。各肠段在第2周内IL-2基因和IFN-γ基因表达水平迅速升高,并在14日龄时达到最高峰,之后各日龄都趋于稳定。另外,各日龄同一肠段IFN-γ基因的表达水平要明显高于IL-2基因的表达水平。证实,鸡GALT在出壳后4日龄就初步具有细胞免疫功能,直至第2周尤其是14日龄时其功能基本达到成熟水平。     

鸡细胞因子实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据鸡IL-6I、L-1β、IFN-γ、TGF-β4 mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经鞭毛蛋白刺激的鸡巨噬细胞HD11总RNA,并反转录成cDNA,建立了实时荧光定量PCR方法。结果显示,融解曲线均呈单一峰;同一份cDNA经过3个相同反应体系的实时荧光定量PCR扩增后,其扩增曲线基本重合。HD11细胞经鞭毛蛋白刺激后,前炎性细胞因子IL-6和IL-1β的相对表达量分别为14.90和29.09,与对照组相比显著升高(P0.05);而IFN-γ与抗炎性细胞因子TGF-β4的相对表达量无显著变化(P0.05)。应用该方法检测了3份沙门菌感染鸡血液样品异嗜白细胞中这4种细胞因子的表达水平,前炎性细胞因子IL-6、IL-1β的相对表达量分别为6.19和2.39,与对照组相比显著升高(P0.05);TGF-β4的相对表达量无明显变化(P0.05)。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好,为定量检测鸡细胞因子的一种快速、准确的方法。     

鸡TLR2信号通路中相关分子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡Toll样受体2(ChTLR2)信号通路中相关分子的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中TLR2信号通路中的5种相关分子即ChTLR2-1,ChTLR2-2,ChTLR6,鸡骨髓分化蛋白88(ChMyD88)及鸡核因子κB(ChNF-κB)基因序列,以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(ChGAPDH)基因为参考基因,设计特异引物扩增目的基因片段。将6种基因克隆至pMD8-T载体后得到各自的阳性克隆质粒,以6种阳性质粒为标准品建立了标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验分析。应用建立的方法对堆形艾美耳球虫核酸疫苗pcDNA/Ea3-1E免疫SPF雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA的转录水平进行检测。结果显示,当标准品稀释度为1×102～1×1010copies/μL时,6种基因Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.995。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。免疫雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA转录水平的检测结果表明,免疫组2种分子mRNA转录水平均极显著高于空白对照组(P<0.01)。本研究为ChTLR...     

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒(ARV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板,用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR GreenⅠ染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感1×103倍,可检测到5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDVI、BDV、MG均不反应;从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒,病毒含量为1×105~1×107个拷贝/μL。表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于ARV的检测。     

鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种鼠源VCAM-1基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为鼠源VCAM-1基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中登录的鼠源VCAM-1基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测鼠源VCAM-1基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.998;灵敏性、重复性及特异性均较高。可用于鼠源细胞中VCAM-1基因的定性鉴别和含量测定。结果表明,成功建立了一种快速准确检测鼠源VCAM-1基因的TaqMan实时荧光定量PCR法。     

CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及评价

为建立一种CD63基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为CD63基因的动态检测提供有效的实验手段,根据GenBank中公布的CD63基因序列,设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测CD63基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数r2为0.997;灵敏性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检出不同类型细胞中CD63的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测CD63基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

鸡IFN-γ基因的原核表达及其表达产物的抗NDV活性

设计了1对特异性引物,从含有广西三黄鸡IFN-γ基因的重组质粒pMD18-ChIFN-γ中扩增出鸡的IFN-γ基因,将该基因插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达质粒pGEX-ChIFN-γ,并将其转入到大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot分析,其分子质量约为42.4 ku,表明鸡IFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。采用NDV国内参考强毒株F48E9对复性后的IFN-γ进行了活性测定;结果显示,IFN-γ的抗病毒活性为1.33×104U/mL。     

泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立一种泛素基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,以期为泛素基因的动态检测提供有效的试验手段。根据GenBank中公布的泛素基因序列设计1对荧光定量PCR引物及1条探针,建立一种快速检测泛素基因的实时荧光定量PCR方法,并对建立的方法进行条件优化与评价。结果显示,建立的实时荧光定量PCR方法的线性关系好,以质粒标准品构建的标准曲线的相关系数r~2为0.999;灵敏性、特异性及重复性均较高;应用建立的方法对多种种属来源细胞进行检测,能检测出不同类型细胞中泛素的含量。结果表明,成功建立了一种快速、准确检测泛素TaqMan实时荧光定量PCR方法。     

重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.     

禽源致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立定量检测禽致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR GreenⅠqPCR方法,设计特异性引物,用PCR扩增irp2基因片段,克隆至载体p MD18-T,转化DH5α细胞,提取阳性重组质粒。以重组质粒为标准模板,建立定量检测irp2基因的特异性荧光定量PCR方法,进行特异性、灵敏度、重复性等性能评价,并对临床分离的187份疑似禽致病性大肠杆菌进行irp2基因定量检测。结果显示,PCR扩增片段的大小为261 bp,与Gen Bank中已知基因序列的同源性为100%,建立的qPCR方法 Ct值与标准品模板在4.1×100~2.3×1010copies/L范围内呈良好的线性关系,扩增曲线呈"S"形,相关系数为0.978,斜率为-3.286。该方法与副鸡嗜血杆菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)无交叉反应,灵敏度达到2.3×100copies/L,比常规PCR高1 000倍,重复性变异系数小于4.00%。使用建立的irp2 qPCR对采集的疑似禽致病性大肠杆菌病料进行荧光定量PCR检测,阳性检出率为36.4%,显著高于普通PCR检测率。结果表明,建立了禽源大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,该方法适用于含HPI+毒力岛致病性大肠杆菌的快速筛选、毒力基因及其转录水平的定量检测,可为禽大肠杆菌病防控提供技术支持。     

惠阳胡须鸡Ⅱ型干扰素基因在毕赤酵母中的表达及其产物活性分析

为了确定惠阳胡须鸡IFN-γ基因(chIFN-γ2)在毕赤酵母中表达的重组蛋白的抗病毒活性和蛋白的二级结构,将pGEM-T-chIFN-γ2重组质粒中的chIFN-γ2基因克隆到表达质粒pPICZαB上,经酶切鉴定、PCR鉴定和测序后的序列同源性分析,证明目的基因没有发生缺失、突变,并且插入方向正确。将重组质粒电转化到毕赤酵母感受态细胞GS115中,阳性转化子经甲醇诱导表达,获得了高效分泌表达。重组IFN-γ的分子质量约为33 ku,表达量达0.604 mg/mL,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV的抗病毒活性为3.2×104U/mg。圆二色性分析表明,IFN-γ酵母重组蛋白属于典型的α螺旋蛋白,二级结构含量为:α螺旋55.1%,β折叠8.3%,转角13.9%,无规卷曲22.8%。采用毕赤酵母分泌表达了有活性的鸡IFN-γ,并首次证明鸡IFN-γ重组蛋白属于典型的α型蛋白。     

I群禽腺病毒SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计了1对引物,建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法.用Ⅰ群禽腺病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA,与鸡减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、传染性腔上囊炎病毒和传染性支气管炎病毒等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应,具有良好的重复性.对保存的3份Ⅰ群禽腺病毒的细胞培养物进行荧光定量PCR检测,结果都为阳性,检测的病毒含量为1×106～1×108拷贝/μL.表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上Ⅰ群禽腺病毒感染的检测.