不同型牛血清对家兔原核胚序贯培养体外发育的影响

采用不同型血清分别添加到TCM199和mTCM199培养液、RPMI1640和mRPMI1640培养液中,对兔原核期受精卵进行了体外序贯培养,并对各组间不同时期发育率进行了分析比较。结果显示:体外培养至第72 h时,3个体外序贯培养体系间8-细胞胚率、桑椹胚率差异不显著(P>0.05),当体外培养至囊胚时,100 mL/L NBS TCM199(mTCM199)培养体系、100 mL/L NBS RPMI1640(mRPMI1640)培养体系的囊胚率均显著低于100 mL/L FBS RPMI1640(mRPMI1640)培养体系的囊胚率(三组的囊胚率依次是27.3%、35.9%、97.2%,P<0.01)。但前两组之间差异不显著。结果表明,不同型血清对兔早期胚胎体外正常发育具有很大影响,序贯培养中添加国产NBS的培养液的培养效果明显低于添加进口FBS的培养液的培养效果。     

妊娠期牦牛子宫肉阜上皮细胞的培养

为建立一种稳定、简便地获得较高纯度的牦牛子宫肉阜上皮细胞的方法,分别采用组织块种植法和联合消化法对妊娠8～10周龄牦牛的子宫肉阜上皮细胞进行原代培养及分离纯化,测试其培养的最适FBS浓度及pH值,并观察其大体形态等。结果显示,胎盘组织样品在37℃下,采用胰蛋白酶和胶原酶1∶1联合消化排除法分离子宫肉阜上皮细胞的效果好。pH6.8～7.0、含150mL/L FBS的DMEM/F12培养基适宜牦牛子宫肉阜上皮细胞的原代培养,pH6.8～7.0、含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基较适宜传代培养。传代5次后经透视显微镜观察发现,细胞为上皮样形态,呈片状铺石路样生长。表明,用联合消化排除法可简单、有效地获得较高纯度的牦牛子宫肉阜上皮细胞。     

牦牛子宫内膜细胞的分离培养及性激素对其增殖的影响

为了分离培养牦牛子宫内膜细胞,并探讨不同浓度雌激素和孕激素对上皮细胞和基质细胞增殖的影响,采用Ⅰ型胶原酶消化、离心分离和差速消化纯化的方法分离纯化上皮细胞和基质细胞,对其进行免疫细胞化学染色鉴定,绘制生长曲线,最后用MTT法测定不同浓度的17β-雌二醇和孕酮对细胞增殖的影响。结果显示,1g/L胶原酶消化1h,500r/min离心10min,经2代差速消化纯化获得的上皮细胞的纯度为96%,基质细胞的纯度为93%;不同浓度的17β-雌二醇均能促进上皮细胞和基质细胞的增殖,孕酮可促进基质细胞的增殖,但对上皮细胞的增殖有抑制作用,不同浓度的17β-雌二醇和孕酮共同作用均能显著促进基质细胞增殖,而对上皮细胞增殖的影响随混合液中孕酮浓度的增加由促进转为抑制。本研究获得了高纯度的牦牛子宫内膜上皮细胞和基质细胞,证实雌激素能促进2种细胞的增殖,孕激素能促进基质细胞的增殖但抑制上皮细胞的增殖。     

绵羊睾丸原代细胞培养及接种羊痘弱毒后的病变观察

研究了在相同培养条件下不同培养液、不同血清和不同细胞密度对绵羊睾丸细胞生长的影响 ,并对该细胞接种羊痘弱毒后的病变情况进行了观察。结果 ,3种培养液对绵羊睾丸细胞生长的支持作用表现为MEM液 >199液 >乳汉液 ,但差异不显著 ;用犊牛血清的最适细胞密度为8.0× 10 5～ 1.0× 10 6 /mL ,用成年牛血清的最适细胞密度为 1.0× 10 6 /mL ,用绵羊血清的最适细胞密度为 8.0× 10 5/mL ;原代培养生长良好的细胞接种羊痘弱毒后出现了明显的细胞病变     

低血清培养PK-15细胞系对TGEV增殖规律的研究

为降低疫苗生产综合成本,本研究探讨了以低血清培养基(M08011)替代常规细胞培养基(DMEM)的可行性。本研究依次采用含100、80、50、30、20、10、0mL/L血清的低血清培养基(M08011)驯化PK-15细胞,并考察猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)在低血清培养的PK-15细胞系中的增殖规律。结果显示,驯化后的PK-15细胞在含100、80、50、30、20 mL/L的低血清培养基中生长状态良好,与常规培养基所培养的PK-15细胞无差异。低血清培养体系培养PK-15细胞时,血清最低添加量为20 mL/L。用该体系培养的PK-15细胞接种TGEV后,TGEV的TCID50为10^-4.97/100μL,与常规条件培养的TGEV的TCID50为104.88/100μL相比,差别不明显。TGEV接种PK-15细胞,低血清培养基中血清浓度降低至20 mL/L,毒价未受到影响。结果表明,本研究建立的PK-15细胞及TGEV低血清培养体系可初步应用于TGEV的增殖培养,为相关疫苗研发奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫DF-1细胞培养体系的建立及应用

为了建立柔嫩艾美耳球虫的鸡胚成纤维传代细胞(DF-1)培养体系,并应用于柔嫩艾美耳球虫子孢子的细胞入侵活力检测,将CFDA-SE标记的子孢子接入DF-1细胞,利用流式细胞仪测定子孢子的细胞入侵活力。比较了37℃和41℃培养温度下,子孢子对DF-1、MDBK、Vero、BHK、MDCK五种细胞的入侵活力。优化了在子孢子入侵活力检测时,DF-1细胞最佳培养条件。结果表明,柔嫩艾美耳球虫子孢子在DF-1细胞中可发育为第一代裂殖子。在不同培养温度下,子孢子对DF-1细胞的入侵活力均高于其他细胞。优化后的DF-1细胞培养体系的培养程序为:用含100mL/L胎牛血清的DMEM稀释DF-1细胞,以每孔1×105个细胞铺被24孔板,37℃、50mL/L CO2培养24h后,用含50mL/L胎牛血清的DMEM换液后,每孔接入3×105个子孢子,41℃、50mL/L CO2培养8～12h,收集细胞进行检测。     

带毒传代工艺在狂犬病细胞苗生产中的应用

狂犬病细胞苗的传统生产方法是取长成“ ”的BHK21 细胞单层,弃去生长液(血清含量 100mL/L),按1.5万mL细胞培养瓶每瓶 40 mL的量接毒旋转,使毒液浸润整个细胞面,37 ℃旋转吸附40~ 60 min,加入 2 000 mL 维持液(含血清 30mL/L),37℃旋转培养48 h后,调pH至7.2~7.4,继续培养至96~120 h,冻毒,收获细胞培养物。传统方法的生产成本高,劳动强度大,种毒使用量大。2004年笔者采用带毒传代工艺生产狂犬病细胞苗,效果较为满意。　　材料　毒种为中国兽医药品监察所提供的狂犬病病毒ERA 株适应株第 1 代毒,经本厂传至第 4代,经检验符合生产…     

猪和兔附红细胞体的体外培养

用RPMI1640和小牛血清按不同比例混合作为体外培养猪和兔附红细胞体的基础培养基,同时以去掉红细胞上自然感染的附红细胞体后的红细胞泥作为培养附红细胞体的寄生载体,进行猪和兔附红细胞体的体外培养。培养结果表明,以 RPMI1640 与小牛血清按 6∶4 比例混合,同时选用兔红细胞泥作为载体的培养效果最佳,接种感染了附红细胞体的猪、兔阳性红细胞后 24 h生长达到高峰,感染率分别为40.2%和31.0%,而采用猪红细胞泥作为培养载体时红细胞感染率无明显升高。     

不同体外培养条件对家兔早期囊胚贴壁行为的影响

采集家兔自然交配后96 h的早期囊胚,以低糖DMEM 150 mL／L胎牛血清 0．1 mmoI／L非必需氨基酸 100 IU／mL青霉素 100 IU／mL链霉素为基础培养基,比较了不同胚胎处理方法、不同饲养层以及培养液中添加不同成分对兔早期囊胚贴壁和增殖的影响,以完善免胚胎干细胞的建系方法。结果表明,以胚胎分割法和链霉蛋白酶-E(proteinase E)处理掉黏蛋白及部分透明带的胚胎容易贴壁和增殖;在小鼠成纤维细胞饲养层和兔胎儿成纤维细胞饲养层上,胚胎的脱带率差别不大,但在小鼠成纤维细胞饲养层上贴壁率明显提高,且贴壁后内细胞团增殖较快;添加胰岛素、白血病抑制因子和β-巯基乙醇均利于抑制ES的分化和促进内细胞团的增殖。     

IBRS_2、BHK_(21)细胞在不同种牛血清中培养的生长状况

1983～1987年,我们采用不同种牛源血清培养和传代IBRS_2和BHK_(21)细胞20000多大转瓶,观察了在中间试生产(以下简称中试)条件下传代细胞的生长状况。 (一) 材料和方法 1.血清种类和来源:①奶犊牛血清:采自上海市、西宁市和兰州市奶牛场出生24～48小时的奶公犊;②小牦牛血清:采自甘肃天祝和甘南牧区2岁以内的小牦牛;③大牦牛血清:用天祝和青海省海南屠宰厂冬季屠宰牦牛放的血制备。     

青海牦牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

采集青海省泽库县某牧户疑似牦牛病毒性腹泻病牛的样品,将RT-PCR检测为阳性的样品处理后接种MDBK细胞,并盲传至第10代,检测每一代细胞中牛病毒性腹泻病毒的E0基因。通过分离株接种细胞后产生的病变效应观察、免疫荧光试验、电镜观察、RT-PCR扩增以及序列分析鉴定了该病毒。结果表明,盲传的每代细胞中均可检测到E0基因;接毒后的细胞在盲传至第7代时出现明显的细胞病变;免疫荧光试验中能观察到细胞内发出的特异性荧光;经浓缩、纯化的病毒在电镜下呈直径为40～60nm的病毒粒子,将其命名为QHZK株。对克隆的E0基因测序后提交至GenBank(登录号:JF927789),并将获得的序列与其他国内外分离株的E0序列比对,同源性为73.6%～98.2%;系统进化分析表明该分离株属于牛病毒性腹泻病毒1b亚型。     

人和畜禽的空肠弯杆菌分离培养及带菌状况调查

对195例不同年龄腹泻病人的粪样及656只健康和腹泻畜禽的直肠和泄殖腔拭子进行空肠弯杆菌培养,总检出率为26.1%(222/851).人和畜禽的带菌率分别为健康蛋用鸡为61.0%(61/100),腹泻后备蛋用鸡为53.3%(40/75),健康后备蛋用鸡为22.0%(11/50),腹泻仔猪为88.0%(88/100),健康羔羊为5.7%(6/106),牦牛犊为12.4%(15/121)和0(0/104)腹泻病人为0.5%(1/195).蛋用鸡各组间的带菌率差异极显著(P＜0.01),腹泻后备蛋用鸡的带菌率明显高于健康后备蛋用鸡(P＜0.01),显示后备蛋用鸡腹泻与该菌感染相关.腹泻仔猪的带菌率很高,也提示该菌感染与仔猪腹泻存在一定关系.噻孢霉素对空肠弯杆菌检出率的影响和抗生素药敏性试验结果表明,噻孢霉素不能替代头孢霉素Ⅰ,而头孢哌酮钠(头孢必)可取代Camp-BAP琼脂中的头孢霉素Ⅰ.在100mL/LCO2气体环境中微需氧培养比烛缸内培养空肠弯杆菌检出率高13.0%,显示分离该菌以100mL/L CO2法明显优于烛缸法(P＜0.01).     

大通牦牛LF基因的克隆与分子特征

通过RT-PCR克隆了牦牛包含LF基因编码区的cDNA序列(GenBank登录号为EU547251);将克隆获得的LF基因的cDNA与乳牛相应序列进行了比对;对牦牛LF蛋白的氨基酸序列(GenBank登录号为ACB29794)与其他物种的相应序列进行了比较,应用在线生物软件对牦牛LF蛋白的特性和结构进行了预测.结果表明,克隆获得的牦牛LF基因cDNA片段长度为2 344 bp,其中LF基因编码区全长2 124bp,编码708个氨基酸;克隆获得的牦牛cDNA序列与乳牛该序列存在15个碱基的变异;各物种LF蛋白具有较高的同源性,LF蛋白进化树符合物种进化规律;牦牛LF蛋白含有α-螺旋36.0%、β-折叠22.4%、β-转角31.1%、无规卷曲12.9%;同源建模预测的LF 3D模型显示,LF为多肽链在二级结构基础上折叠形成的2个极相似的、对称的球状叶,即N叶和C叶,中间由一段对蛋白酶敏感的α-螺旋连接,呈"二枚银杏叶型"结构.     

西北和西南五省(区)部分地区黄牛 牦牛牛病毒性腹泻/粘膜病血清学监测

从陕西、甘肃、宁夏、青海和四川五省（区）部分地区的黄牛群、牦牛群采集血清,用细胞中和试验检测牛病毒性腹泻／粘膜病（ＢＶＤ／ＭＤ）抗体,结果黄牛群ＢＶＤ／ＭＤ阳性检出率为４６．１５％,其中宁夏黄牛群的感染率最高（５５．９５％）,其次为甘肃（４１．４８％）和陕西（４０．６０％）;牦牛群ＢＶＤ／ＭＤ的阳性检出率为３０．０８％,其中四川牦牛群感染率最高（３８．４６％）,其次为甘肃（２９．４１％）和青海（２８．００％）。     

γ-氨基丁酸对离体培养牦牛黄体细胞凋亡的影响

用离体培养方法观察了γ 氨基丁酸 (GABA)对牦牛黄体细胞凋亡及羟自由基 (OH )生成的影响。结果表明 ,GABA能促进黄体细胞OH的生成并诱导黄体细胞凋亡。     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16 S rDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内容物为材料,用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养,分离到50株乳酸菌,经生化鉴定为嗜热链球菌(2株)、乳酸乳球菌(1株)、保加利亚乳杆菌(5株)、嗜粪乳杆菌(10株)、嗜酸乳杆菌(8株)、乳酸乳杆菌(9株)、肠乳杆菌(10株)、弯曲乳杆菌(5株)。采用乳酸菌16 S rDNA通用引物,对分离的8种菌的16 S rDNA一段可变区序列进行扩增,均得到大小约470 bp的产物;扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较,同源性均大于97．5％,同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实,牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富,且乳杆菌的数量较多,这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

牦牛舌抗菌肽基因cDNA的克隆及其在生殖系统中的表达

为了解牦牛舌抗菌肽(LAP)基因序列的特征及其在生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR法从牦牛睾丸、附睾组织中扩增LAP基因,重组到pMD19-TSimple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR检测了雌性牦牛生殖系统(卵巢、输卵管、子宫、阴道等组织)中LAPmRNA的表达。结果显示,克隆的LAP基因包含一195bp的完整开放阅读框(ORF),与牛LAP基因相似性达97.9%,该ORF编码的64个氨基酸含有β-防御素特征性结构,即6个在特定位置上的保守半胱氨酸残基;LAP在牦牛生殖系统上皮组织中均有表达。推测LAP在牦牛生殖系统的先天免疫中具有重要作用。     

微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型的建立及不同阶段虫体形态的观察

利用人回盲肠癌(HCT-8)细胞作为感染细胞,采用不同的接种细胞浓度和培养血清浓度进行培养,观察细胞的生长状况;在培养细胞中加入1×105个经活力检测的微小隐孢子虫卵囊,培养72h后用荧光标记的隐孢子虫卵囊、子孢子染色试剂盒Crypt-a-Glo和Sporo-Glo进行染色,观察不同发育阶段的隐孢子虫形态。结果显示,在六孔培养板中接种10×105个细胞后,24h后长成80%～100%单细胞层,可以用来接种微小隐孢子虫。培养72h后观察到了隐孢子虫各个阶段虫体的形态。结果表明,成功建立了微小隐孢子虫感染HCT-8细胞模型。