CpG序列对副伤寒疫苗免疫小鼠应答反应的影响

研究了CpG序列作为分子免疫增强剂 ,对常规副伤寒疫苗免疫小鼠后 ,小鼠体液和细胞免疫反应的变化情况。试验结果显示 ,CpG序列作为免疫增强剂 ,可以使免疫小鼠的总IgG含量、血清特异性抗体效价、淋巴细胞IL 2的诱生活性和脾淋巴细胞的增殖反应有明显的提高。结果表明 ,CpG序列能显著增强免疫动物对常规疫苗的免疫应答反应水平 ,可以作为提高疫苗免疫效果的有效途径     

九种中药成分对体外培养小鼠淋巴细胞功能的影响

为进一步探索黄芪多糖等9种中药成分免疫增强活性的作用机理并比较各成分之间免疫增强活性的强弱,在体内试验的基础上,用脾淋巴细胞增殖反应和抗体夹心酶联免疫吸附试验测定了它们对体外培养的小鼠淋巴细胞功能的影响。结果表明,人参皂甙、蜂胶黄酮、黄芪多糖、淫羊藿黄酮、淫羊藿多糖都能显著地直接或协同ConA刺激脾和外周血淋巴细胞增殖,也能显著增加LPS诱导的脾淋巴细胞增殖活性和显著升高体外培养的小鼠脾淋巴细胞产生的IgG水平;当归多糖能协同ConA和LPS的诱导活性,提高小鼠脾淋巴细胞体外培养系统的IgG水平;黄芪皂甙能直接和协同LPS刺激淋巴细胞增殖,板蓝根多糖则仅能促进LPS的诱导活性,蜂胶多糖的作用则均不明显。     

阳离子脂质体包裹CpG对猪瘟猪肺疫猪丹毒三联疫苗免疫效应的影响

对 3组分别注射猪瘟猪肺疫猪丹毒三联疫苗 (简称三联疫苗 )、CpG +三联疫苗、阳离子脂质体包裹CpG +三联疫苗的小鼠细胞和体液免疫反应进行了比较分析。结果显示 ,阳离子脂质体包裹CpG +三联疫苗免疫小鼠脾细胞增殖反应明显增强 ,白细胞介素 2 (IL 2 )诱生活性和免疫细胞数量、血液IgG含量较仅注射三联疫苗的小鼠显著增加。说明阳离子脂质体包裹CpG能增强小鼠对三联疫苗的体液和细胞免疫应答反应 ,使疫苗的免疫原性增强     

PCV2 ORF2 B细胞表位与PPV VP2真核表达质粒的构建及其免疫原性

为了研究猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2B细胞表位与猪细小病毒(PPV)VP2重组真核表达质粒的免疫原性,将PCV2ORF2的B细胞表位基因(141～257bp)重组到PPV SC-1株VP2基因的N端,构建了真核表达质粒pCI-VP2.ORF2B。用脂质体转染法将重组质粒pCI-VP2.ORF2B转染至Vero细胞中,利用间接免疫荧光法检测其在体外的表达情况。将重组质粒免疫小鼠,并设猪细小病毒灭活疫苗、猪圆环病毒亚单位疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+淋巴细胞比例,PCV2和PPV IgG抗体效价进行了检测。结果表明,转染Vero细胞后第48小时用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达;pCI-VP2.ORF2B免疫组脾淋巴细胞从第7天开始对ConA有明显反应,显著高于对照组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组;在免疫后第14天检测到PPV/PCV2IgG抗体。提示pCI-VP2.ORF2B能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应。     

PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原优势区基因真核表达质粒的构建及其免疫效果

采用PCR法扩增猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2抗原优势区(ORF2′)基因和猪细小病毒(PPV)VP2基因,将目的基因定向插入真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2′-VP2。将重组质粒免疫小鼠,同时设立PCV亚单位疫苗、PPV灭活疫苗和空载体对照组,采用MTT比色法、流式细胞术和ELISA法分别对免疫小鼠脾淋巴细胞的转化功能,外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞比例,PCV2和PPVIgG抗体效价进行了检测。结果表明,从免疫后第7d起,pCI-ORF2′-VP2免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞比例和抗PCV2、PPV的特异性抗体效价都显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于空载体对照组,且重组质粒组在第21～42d诱导的免疫水平显著或极显著强于PPV灭活疫苗组。证实,构建的重组质粒pCI-ORF2′-VP2能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

鹅细小病毒VP3基因疫苗与弱毒疫苗诱导小鼠免疫应答的比较

为阐明小鹅瘟基因疫苗与弱毒疫苗诱导细胞免疫和体液免疫的不同机理,将小鹅瘟VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别按6μg/只基因枪轰击和100 μg/只肌肉注射,小鹅瘟弱毒疫苗按100 μL/只肌肉注射免疫BALB/c小鼠,同时以pcDNA3.1(+)和生理盐水为对照.于免疫后第3、7、14、21、28、35、49、63、77、105 d采集抗凝血,用淋巴细胞转化试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)分别检测小鼠外周血T淋巴细胞的转化效果和CD4+、CD8+T淋巴细胞的动态变化,另外,在以上10个时间段以及免疫后第133、161、189、217 d分别采集凝血,用间接ELISA检测小鼠特异性IgG抗体水平.结果显示,pcDNA-GPv-VP3免疫小鼠的外周血T淋巴细胞对ConA刺激的反应,诱导的CD4+、CD8+T淋巴细胞免疫功能和血清IgG抗体水平在不同时间段都显著或极显著高于弱毒疫苗免疫组.3个免疫组小鼠都能诱导产生细胞免疫和体液免疫应答,并且基因疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫和体液免疫应答比弱毒疫苗免疫组强.     

猴头菇多糖对小鼠脾淋巴细胞体外增殖及细胞周期的影响

为探索猴头菇多糖(HEP)对小鼠脾淋巴细胞体外增殖及细胞周期的影响,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测HEP单独或协同ConA、LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响;用流式细胞仪检测小鼠脾淋巴细胞周期的变化。结果显示,HEP的质量浓度在6.25~100μg/mL范围内能显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖,且48h效果最佳;HEP与ConA或LPS共同作用小鼠脾淋巴细胞时,小鼠脾淋巴细胞的D570nm值高于ConA和LPS单独作用的,表现出明显的协同效应。流式细胞仪检测结果表明,HEP通过促进脾淋巴细胞从G0/G1期进入S期,从而促进脾淋巴细胞增殖。结果表明,HEP可单独或协同ConA、LPS促进小鼠脾淋巴细胞增殖及DNA的合成。     

CpG ODN对传染性腔上囊病病毒活疫苗免疫效果的影响

将120只来航系SPF鸡随机分成对照组、注射CpG ODN组、IBDV活疫苗点眼免疫组及IBDV活疫苗 CpG ODN免疫组,每组30只,于7日龄时对试验鸡进行初次免疫,21 日龄时进行加强免疫,28日龄时用IBDV野毒株攻毒。检测不同时间的IBDV特异性抗体效价、血液和脾淋巴细胞的Con A刺激指数(SI)。结果表明,CpG ODN处理后脾细胞的增殖转化能力强于血液淋巴细胞的增殖转化能力;CpG ODN的使用使血清中IBDV特异性抗体产生时间提前7 d,抗体效价升高;与对照组相比,仅用CpG ODN处理就可使1/3的鸡攻毒后迅速产生高效价(约1∶3 000)的特异性抗体,降低了发病率和死亡率,证明CpG ODN能增强IBDV活疫苗的免疫效果。     

蕨麻多糖对小鼠淋巴细胞增殖和一氧化氮分泌的影响

为探讨蕨麻多糖(Potentilla anserinepolysaccharide,PAP)免疫调节的作用机理,观察了PAP对小鼠脾淋巴细胞体外增殖和分泌一氧化氮的影响。结果显示,50 mg/L PAP配合ConA或LPS(lipopolysaccharide,脂多糖)能使小鼠脾淋巴细胞在体外显著增殖(P<0.05);100、200及400 mg/L PAP配合ConA或LPS可使小鼠脾淋巴细胞在体外极显著增殖(P<0.01);与对照组相比,PAP以不同浓度(50~400 mg/L)处理小鼠脾淋巴细胞后一氧化氮分泌量均显著升高(P<0.05)。试验结果表明,蕨麻多糖能明显促进体外培养的小鼠脾淋巴细胞增殖和分泌一氧化氮,与ConA或LPS有协同作用。     

猪生殖与呼吸综合征病毒GP5基因对小鼠的DNA免疫

将表达完整猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和融合表达泛素与GP5成熟肽的真核重组表达质粒(pCI-GP5和pcDNA-U-GP5)分别肌肉注射免疫BALB/c小鼠,共免疫3次。采用间接ELISA法检测血清中抗GP5的抗体水平,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖能力,LDH释放试验检测脾NK细胞的杀伤活性,并通过流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群的比例。结果发现,2种DNA重组质粒免疫后均可诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫。三免后第5周,pCI-GP5质粒免疫组诱导产生的抗GP5抗体水平及NK活性明显高于pcDNA-U-GP5质粒免疫组;而pcDNA-U-GP5免疫组的淋巴细胞增殖指数及CD4-CD8 T细胞比例明显高于pCI-GP5组。表明,GP5基因可诱导产生较高的免疫反应,泛素与GP5的融合表达可增强PRRSV GP5诱导的细胞免疫反应。     

含CpG基元的SARS冠状病毒S-1基因片段DNA疫苗的构建及动物试验

设计了3对含不同数目CpG基元(CpGmotifs)的引物,用SARS冠状病毒(SARSCoV)S1基因片段作为靶基因,通过PCR扩增出目的片段,插入真核表达载体pVAX1中。用电击法把构建好的不同质粒注入相应组BALB/c小鼠的股四头肌,2周后再加强免疫一次。每周分别测定血清IgG1和IgG2a抗体水平。结果,免疫组IgG1和IgG2a抗体浓度以及IgG2a与IgG1的比值均显著增加(P<0.001)。表明所构建的SARSCoVS基因S1片段的真核表达质粒可诱导小鼠产生很强的免疫反应。     

盖塔病毒6K蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为用于猪群中盖塔病毒(Getah virus,GETV)的流行病学调查,并研究其6K蛋白功能,制备了该蛋白的单克隆抗体。将6K基因克隆至原核表达载体pCold-TF,并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG低温诱导表达。将诱导的重组菌超声裂解,离心后收集上清,经过镍柱亲和和切胶纯化后,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。使用间接免疫荧光(IFA)法筛选阳性杂交瘤细胞,获得1株GETV 6K单克隆抗体,命名为25C5。将其注射小鼠腹腔,制备6K单抗腹水。IFA检测结果显示,单抗25C5可以结合GETV蛋白并产生特异性荧光。在Western-blot和免疫沉淀试验中,单抗25C5可以结合GETV感染的ST-R细胞样品,其特异性条带大小约6 ku。以上结果表明,单抗25C5免疫学反应特性良好,可用于检测GETV,为该病毒的分离鉴定、致病机制和蛋白功能等研究奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S-N融合双基因疫苗的构建及其免疫原性分析

为了构建TGEV S-N融合双基因疫苗并分析其免疫原性,从S、N基因克隆质粒中以PCR扩增了S基因(2.1kb,含A、B、C、D抗原位点)和N基因(1.2kb),将S基因插入pVAX1载体构建了pVAX-S质粒,再将N基因插入pVAX-S中S基因末端,构建了融合表达S、N双基因的重组质粒pVAX-S-N,将pVAX-S-N转染COS7细胞以免疫荧光试验进行S、N双基因的表达鉴定。用纯化的pVAX-S-N和作为对照的pVAX-S、pVAX1、PBS免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,分别测定免疫后第0、14、28、42天的小鼠血清IgG抗体,测定免疫后第42天小鼠外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)的数量。结果,融合质粒pVAX-S-N可在COS7细胞特异性表达S、N两个蛋白,pVAX-S-N免疫小鼠后第14天即可诱导产生抗TGEV的特异性IgG,但pVAX-S-N诱导的抗体水平一直低于pVAX-S诱导的抗体水平,在免疫后第42天差异极显著(P<0.01);pVAX-S-N可激发小鼠产生细胞免疫应答,但pVAX-S-N组的CD3+、CD4+、CD8+数量均低于pVAX-S免疫组。研究结果表明,融合双基因疫苗pVAX-S-N具有免疫原性,但免疫效果却不如单基因疫苗pVAX-S的理想。     

应用BALB/c小鼠评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力

用不同剂量的口蹄疫灭活疫苗免疫3组雌性BALB/c小鼠,同时设空白对照组,每组8只。免疫后每7 d采血一次,用液相阻断ELISA(LPB-ELISA)检测血清抗体水平;第28 d用800LD50同源强毒攻击,攻毒后36 h,每组随机选取3只BALB/c小鼠,采全血,分别用每只BALB/c小鼠全血注射12只乳鼠,每组共注射36只乳鼠,以乳鼠试验判定BALB/c小鼠的病毒血症和攻毒保护情况。结果表明,免疫组BALB/c小鼠均可产生特异性抗体,保护率分别为75.0%、63.9%、36.1%;对照组小鼠血清抗体为阴性。提示,BALB/c小鼠可以用来评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。     

猪泛素基因与PRRSV GP5基因融合表达质粒的构建及其免疫效果

构建了泛素(ubiquitin,Ub)基因与密码子优化的PRRSV GP5蛋白(optiGP5)基因融合表达质粒pIR-Ub-optiGP5。间接免疫荧光和Western-blot分析表明,重组质粒转染293T细胞后能够瞬时表达。将pIR-optiGP5和pIR-Ub-optiGP5两种质粒DNA肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,分别检测小鼠血清中抗GP5抗体、T淋巴细胞的增殖能力以及CTL活性。结果显示,pIR-optiGP5质粒免疫组在二免后可以检测到荧光抗体,而pIR-Ub-optiGP5质粒免疫组一直未检测到抗GP5抗体,但该免疫组的T淋巴细胞增殖指数及针对GP5的特异性CTL反应数值明显高于pIR-optiGP5质粒免疫组。这表明泛素与GP5的融合表达可增强细胞免疫反应。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白的单抗制备及抗原表位鉴定

用猪瘟病毒石门株E2(SM-E2)的BC区原核表达蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单抗,测定其效价并鉴定抗原表位。结果表明,制备了1株持续、稳定分泌抗SM-E2的单克隆抗体2B10,效价在1∶600～1∶1 000之间。单抗2B10能与常规SDS-PAGE转膜的SM-E2蛋白发生反应,表明其识别的是线性表位,并且该单抗只能识别石门毒株,而不能与C株疫苗及2型流行毒株发生反应。点突变E2蛋白ELISA分析结果表明,该单抗不与707、709、711、713和714位突变蛋白发生反应,表明单抗2B10识别的线性表位为707I-X-P-X-G-X-G-G714。该单抗对猪瘟病毒抗原多样性分析和致病机制研究有一定的应用价值。     

布鲁氏菌pcDNA3.1-omp17.3基因疫苗的研制

采用PCR方法扩增了布鲁氏菌17.3 ku外膜蛋白编码基因,并将该基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-omp17.3。pcDNA3.1-omp17.3转染COS-7细胞后,通过Western-blotting检测到了17.3 ku蛋白的瞬时表达。将pcDNA3.1-omp17.3免疫小鼠,三免后经ELISA、流式细胞仪以及ELISPOT技术检测到pcDNA3.1-omp17.3在小鼠体内诱导产生了以Th1型为主的细胞免疫应答。结果表明,构建的基因疫苗可作为潜在的布鲁氏菌新型疫苗,有进一步研究的意义。     

羊口疮病毒F1L与B2L基因核酸疫苗联合免疫小鼠特性的研究

为评价羊口疮病毒(OrfV)F1L与B2L基因核酸疫苗PVAX1-F1L、PVAX1-B2L联合免疫小鼠诱导体液和细胞免疫的应答效果,分别将PVAX1-F1L+PVAX1-B2L、PVAX1-B2L、PVAX1-F1L、PVAX1空载体与PBS通过后腿肌肉注射方式免疫小鼠,采用ELISA方法检测免疫不同时间段的小鼠血清中OrfV特异性抗体及细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ,并通过MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖反应。结果显示,PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫组小鼠血清抗体效价及IL-2、IFN-γ细胞因子水平显著(P<0.05)高于PVAX1-F1L和PVAX1-B2L单独免疫组,IL-4细胞因子水平差异不明显,但均与PVAX1空载体和PBS组差异极显著(P<0.01);PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖水平与PVAX1-F1L和PVAX1-B2L单独免疫组相比,差异显著(P<0.05),与PVAX1空载体和PBS组相比,差异极显著(P<0.01)。结果表明,PVAX1-F1L+PVAX1-B2L联合免疫小鼠能够增强OrfV特异性抗体的分泌和细胞免疫应答,这为羊口疮新型疫苗的研制奠定了理论基础。     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。