抗人转铁蛋白单链抗体的研制及部分性能研究

研制人转铁蛋白的单链抗体。以纯化人转铁蛋白免疫小鼠,制备小鼠脾脏 mRNA,RT-PCR 扩增重轻链可变区基因;Linker 连接及引入 Sfi Ⅰ和 NotⅠ酶切位点构建单链抗体基因;同载体 pCANTAB 5E 连接,转化 E.coliTG1细胞,以 M13K07挽救制备噬菌体抗体呈现文库,筛选抗原阳性重组噬菌体粒子(Panning);感染 E.coliHB2151菌株,制备可溶抗体并检测其性质;测定抗体基因序列并分析同源性及结构特征。制备出4株分泌抗人转铁蛋白可溶抗体的 E.coli HB2151菌株。抗体基因只由小鼠抗体的轻重链可变区基因构成,开放读码,无终止子,并紧接一末尾为一琥珀终止密码的 E 末端序列,其对应氨基酸序列 V_H 和 V_L 部分均遵从抗体可变区特征。实验证明,可把基因工程抗体技术应用于法医血清学,以制备新型抗体试剂。     

鼠抗人转铁蛋白单链抗体基因的构建

目的为了得到可经载体连接表达、并只由抗体可变区构成的单链抗体基因而进行本实验.方法经扩增得到的鼠抗人转铁蛋白抗体轻、重链可变区基因经凝胶电泳分离、离心柱纯化及定量,同能柔性折叠的一段短连接肽基因一起进行扩增拼接反应,而后在含限切酶位点的引物指导下扩增引入限切酶SfiI和NotI的酶切位点识别序列,产物以电泳鉴定、纯化和定量,再分别用SfiI和NotI酶切消化,最后再柱纯化.结果得到了携带可与载体连接的粘性末端的鼠抗人转铁蛋白单链抗体基因.结论两个不同的基因通过两端含互补序列的第三个基因片断可只经过扩增而无需DNA连接酶的作用而连接起来.对于抗体基因可由此而产生新的轻重链基因的组合,有可能产生性能更优异的抗体.     

鼠抗人转铁蛋白单链抗体基因序列测定及分析

从携带人转铁蛋白单链抗体基因载体转化的大肠杆菌菌株中提取质粒,经电泳分析及筛选、纯化出线状质粒DNA,定量后以载体上人转铁蛋白单链抗体基因插入子两边的已知DNA序列经合成后作为引物进行测序扩增凝胶电泳,将得到的人转铁蛋白单链杭体基因序列重轻链可变区部分同基因库中鼠抗体重轻链进行同源比对,证明人转铁蛋白单链抗体基因确由鼠抗体重轻链可变区基因构成,在此基础上,进一步对基因核苷酸序列的可变区结构特征作推断分析,并推导出其对应的氨基酸序列.     

鼠抗人转铁蛋白抗体轻链与重链可变区基因库的制备

以纯化的人转铁蛋白免疫小鼠,测其血清效价,合乎要求后杀鼠取脾脏并以异硫氰酸胍和酚的混合溶液将其匀浆,再以氯仿抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤,所得总RNA以oligo(dT)纤维素离心柱分离纯化制备mRNA,使mRNA达到eDNA合成所需的浓度后,反转录制备出eDNA,在合成的eDNA中加入轻、重链引物,扩增制备出小鼠抗人转铁蛋白抗体的轻、重链可变区基因库。     

2002年《刑事技术》总目录(第151～156期)

国内外刑技动态第二届国际刑警组织DNA用户大会概述２：３在改革中拓展刑事科学技术工作２：６国际反伪造货币研修班简介３：３澳大利亚“第六届国际临床法医学研讨会”概况４：３论著鼠抗人转铁蛋白单链抗体基因的表达１：３中国汉族人耻骨性别判定的研究２：８５０２指印的光学加强方法研究２：１０紫外反射照相显现指印与５０２胶熏显指印方法的比对３：５四肢关节活动度测量方法研究４：５短波紫外反射照相显现胶带粘面潜在指印５：３桡骨性别鉴定的研究５：７抗人血红蛋白胶体金检测试剂条的研制５：１０技术交流血手印显现的实验研…     

MMP-11多克隆抗体的制备及其法医学意义

目的制备兔抗人基质金属蛋白酶-11(MMP-11)多克隆抗体,建立用MMP-11抗体检测月经血的可行方法,探讨其法医学意义。方法将用基因工程制备的人MMP-11融合蛋白免疫新西兰白兔,饱和硫酸铵法进行抗体纯化。运用蛋白印迹法检测月经血痕、外周血痕、阴道液斑、精液斑、唾液斑和尿液斑,盲测验证该方法的可靠性。结果高效价的兔抗人MMP-11多克隆抗体检测月经血MMP-11蛋白的阳性率为90.48%(93/105),而外周血痕、精液斑、唾液斑、尿液斑和阴道液斑均未检出MMP-11。结论用自制的抗MMP-11多克隆抗体所建立的蛋白印迹法检测月经血中的MMP-11特异性好,灵敏有效,可用于月经血及外周血的鉴别。     

兔抗吗啡多克隆抗体制备

先将吗啡在 6 -羟基位改造为 6 -琥珀酰吗啡 ,再通过碳二亚胺将其与牛血清白蛋白或卵蛋白胶连分别制备免疫原和检测原 ,免疫新西兰大白兔制备出高效价 (1∶ 12 80 0 )抗吗啡多克隆抗体 ,为进一步制备抗吗啡单克隆抗体奠定基础     

用特异兔抗人精蛋白抗体间接ELISA法检测人精斑

本文报告了利用抗人精血清进一步精制而得的特异兔抗人精蛋白抗体进行间接ELISA试验检测人精斑的方法。经用61例各种常见体液斑检材及多人不同浓度的精液、唾液、乳汁、血液等体液稀释液进行测试,正确检出精斑的准确率达100％。本法抗体来源方便,无需特殊仪器设备,操作简单,便于使用。     

单克隆抗A、抗B抗体的简易提纯和标酶

本文运用辛酸提取法,对小鼠腹水中的单克隆抗 A、抗 B 抗体进行纯化,并用辣根过氧化物酶(HRP)加以标记,获得纯度好,抗体活性强,酶标克分子比值符合要求的酶环单克隆抗 A、抗 B抗体。     

SMCY性别特异融合抗原的克隆表达及其抗体制备

目的利用蛋白检测的快速性优势,研究不同性别在SMCY抗原氨基酸序列的差异,筛选出特异性氨基酸序列,并克隆表达性别特异融合抗原,制备相应抗体,建立一种快速鉴别法医物证性别的方法。方法通过对人SMCY和SMCX进行序列分析,发现了三段差异片段,采用搭桥PCR方法获得差异片段全长基因,连接入p ET-28a载体进行原核表达,用Ni柱纯化后的性别特异融合抗原免疫制备多克隆抗体,用ELISA法和western blot检测SMCY多抗与抗原的反应特异性,制作胶体金试纸条检测样本。结果筛选出具有性别特异性的氨基酸序列,获得SMCY性别特异融合抗原,成功制备出多克隆抗体及胶体金试纸条。结论获得SMCY性别特异融合抗原具有很好的抗原活性,制备的多克隆抗体可以与抗原特异性地结合,用于性别鉴定。     

分泌抗人精子单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定

建立两株分泌抗人精子单克隆抗体的杂交瘤细胞株G_8与E_(10),采用洗涤人精子免疫Balb/c小鼠,取免疫脾与Balb/c小鼠的Sp2/0骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞诱生腹水的方法。Elisa,IIF或酶标抗体免疫组化法结果发现,G_8与E_(10)单抗与人精子(射出精子、睾丸、副睾管及输精管中的精子)及睾丸各级生殖细胞均发生反应;与人甲状腺上皮细胞、肾小管上皮细胞、胰腺导管上皮细胞以及胰岛均发生不同程度的交叉反应,与其他33种人体正常组织、9种人体液与分泌液、8种不同种族的动物精子均不发生交叉反应,说明在一般情况下这两种抗体可用于鉴定人类的精液斑以及精液与阴道分泌液的混合斑。两种单抗与人精子的顶体部、赤道部、后核帽、颈部及中段结合,证明精子特异性表面抗原分布于这几个区域。两种抗体均属IgG_1,G_8与E_(10)抗体的效价分别为1:512与1:1024。     

抗人血红蛋白胶体金检测试剂条的研制

目的制备法医学检验所用的确定人血的免疫胶体金层析试剂条。方法选取抗人血红蛋白单克隆细胞株,制备其小鼠腹水,从腹水中纯化出单克隆抗体。制备胶体金并用一纯化的单克隆抗体包被,制成免疫胶体金。取玻璃纤维以免疫胶体金浸泡,烘干。在一硝酸纤维素膜上两个不同位置分别点加另一抗人血红蛋白抗体和羊抗鼠IgG。搭建试剂条并检测其灵敏度和特异性。结果制成的免疫胶体金试剂条可对稀释至20万倍的人血红蛋白溶液显示阳性,对法医学检验常见8种动物的血溶液显示阴性。结论所制备抗人血红蛋白胶体金试剂条可以应用于法医学检验。     

重组纤维连接蛋白EDA-EDB融合蛋白的分子克隆

目的构建重组pET28a-EDA-EDB质粒,制备重组纤维连接蛋白EDA-EDB融合蛋白。方法采用基因重组技术,将EDA、EDB基因片段连接,再将该重组基因插入pET28a表达载体,表达重组融合EDA-EDB蛋白后,利用6×His/Ni-NTA纯化系统进行纯化,免疫印迹法检测。结果成功连接EDA、EDB基因片段,重组pET28a-EDA-EDB质粒;在大肠杆菌BL21(DE3)中高度表达重组蛋白,获得较纯的重组蛋白,免疫印迹法证实为FN的组分。结论EDA-EDB重组蛋白能采用pET系统在大肠杆菌中表达,并可通过6×His/Ni-NTA纯化系统进行纯化而获得免疫原。     

Possible common partial antigens in human Ig allotype structure and ubiquitous bacteria, studied with the example of Escherichia coli

As can be learned from the literature, bovine serum may contain antibodies directed against human immunoglobulin allotypes. This gave rise to the question of what the origin of those antibodies is. We tested bacteria (E. coli) by means of the haemagglutination inhibition assay, which is used to type either Gm or Km factors. Anti-G1m(2) and anti-G3m(10)-specific antibodies were inhibited by the bacteria in a clear-cut manner, as was anti-Km(1), albeit less significantly. In contrast, the bacteria tested almost totally failed to inhibit anti-G3m(21) serum. The results lead to the assumption that E. coli may carry both Gm- and Km-like antigenic structures, which are presumably the antigenic material leading to immunization of cattle. Furthermore, new attention is drawn to a mechanism for immunization which is discussed regarding the genesis of either AB0 isoagglutinins in man or other "naturally occurring" antibodies.     

检验人精浆特异蛋白P30免疫胶体金试剂条的研制

目的制备用于检验人精浆特异蛋白P30-主要是来自法医学案件的免疫胶体金层析试剂条.方法选取针对不同抗原决定簇的抗P30单克隆抗体细胞株,并制备其小鼠腹水,分离纯化单克隆抗体.制备胶体金并以纯化抗体包被,制成免疫胶体金,以免疫胶体金浸泡玻璃纤维.选取适宜的硝酸纤维素膜并于其上不同位置以未金标的另一株P30单克隆抗体和羊抗鼠IgG包被.搭建试剂条并检测其灵敏度和特异性.结果所制成的试剂条灵敏度至少可达4ng/ml;对6人份混合的人精液物质在稀释20万倍后仍出阳性结果,且无非特异性反应.结论检验人精浆特异蛋白P30的免疫胶体金试剂条可对嫌疑人精物质做出排查,有利于法医物证检验.