牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达。提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体。     

山羊痘病毒RPO30基因绿色荧光蛋白质粒的构建及融合表达

为了研究针对山羊痘病毒RPO30的siRNAs的干扰效果,构建了RPO30基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达.通过对RPO30基因进行PCR扩增,克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切及测序鉴定;将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和RPO30...     

表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建

为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C.以GTPV胸苷激酶基因序列中的Kpn Ⅰ酶切位点为插入位点.将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C.将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV.     

微小隐孢子虫P23基因真核表达质粒在HeLa细胞中的表达及其免疫小鼠血清抗体效价的检测

为观察微小隐孢子虫P23基因真核重组质粒在He La细胞中的表达及免疫小鼠血清抗体产生情况,通过设计特异性引物,利用PCR技术,对微小隐孢子虫卵囊基因组DNA进行P23基因扩增;将扩增产物插入真核表达载体p VAX-1中,构建重组真核表达质粒p VAX1-P23,转染He La细胞,运用间接免疫荧光法及Western-blot技术,验证重组质粒在He La细胞中的表达情况;将重组质粒p VAX1-P23免疫小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清特异性抗体产生情况。结果显示,成功地扩增了长度约为336 bp的微小隐孢子虫P23基因;双酶切和序列测定结果显示,构建的真核重组表达质粒p VAX1-P23中外源基因序列和插入位置正确;间接免疫荧光法及Western-blot分析显示,p VAX1-P23真核重组表达质粒在He La细胞中被成功表达;小鼠免疫重组质粒2周后,即可检测到抗体产生,直至第8周试验结束。结果表明成功地构建了真核重组表达质粒p VAX1-P23,该重组质粒能在He La细胞和小鼠体内表达,并诱导小鼠产生显著的体液免疫反应,为进一步开展隐孢子虫P23蛋白特性研究、研制抗隐孢子虫病核酸疫苗奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒F基因真核载体的构建与表达

根据GenBank中小反刍兽疫病毒(Nigeria 75/I株)F基因序列设计了引物,应用RT-PCR方法获得了目的基因,纯化回收后将其连接到克隆载体pMD18-T上.将鉴定与序列测定后的目的基因再克隆到真核表达载体pEGFP-N1上,经过鉴定,成功构建了含有小反刍兽疫病毒F基因的真核细胞表达栽体pEGFP-N1-F.利用脂质体介导阳性pEGFP-N1-F质粒转染了BHK-21细胞.Western-blotting证实,表达的pEGFP-N1-F融合蛋白(90 ku)具有免疫活性.     

山羊痘DNA疫苗pVAX1-P32的构建及其安全性评估

为了构建山羊痘病毒(GPV)P32基因真核表达质粒pVAXl-P32,探讨pVAXl-P32重组表达质粒作为DNA疫苗在小鼠体内的组织分布和生物安全性。以pMD18-T-P32/LD为模板,通过PCR扩增GPVP32基因片段,并定向插入真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-P32,将其转入大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆进行双酶切与PCR鉴定。大量提取纯化重组质粒pVAX1-P32,经肌肉注射免疫小鼠,于免疫后不同时间剖杀小鼠,分别采集心肌、肝、脾、肺、肾、脑、十二指肠、腿肌、血液等组织样品,抽提总DNA,利用PCR分析pVAX1-P32在小鼠组织内的动态分布及其与宿主细胞染色体的整合情况;同时,以PCR技术检测免疫小鼠粪便,分析pVAX1-P32重组表达质粒在外界环境中的释放情况。结果表明,真核表达重组质粒pVAX1-P32的双酶切鉴定及PCR扩增结果与预期结果相符;肌肉注射小鼠后,pVAX1-P32迅速分布到小鼠其他组织器官中,同时,未发现pVAX1-P32与宿主细胞染色体有整合现象;粪便中也均未检测到目的基因。表明,成功构建了真核表达重组质粒pVAX1-P32,且其作为疫苗对动物和环境是安全的。     

猪圆环病毒2型ORF2基因插入猪细小病毒VP2基因3'端对病毒样颗粒形成的影响

以猪细小病毒(PPV)四川分离株SC-1的VP2基因3'端为靶点,在第1215和1216位之间插入长约700 bp的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因片段,将重组后的PPV VP2-PCV2 ORF2克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建了重组质粒pEGFP.VO;经酶切和PCR鉴定后,采用脂质体介导法将重组质粒pEGFP.VO转染COS-7细胞,应用倒置荧光显微镜、电镜、免疫荧光以及生物信息学技术对表达产物进行观察分析.结果显示,重组质粒pEGFP.VO在COS-7细胞中得到表达,但在电镜下没有观察到病毒样颗粒.通过对PPV衣壳蛋白的三维结构分析及免疫荧光检测发现,PCV2 ORF2基因的插入位点位于PPVVP2基因的3'端,相应表达产物则位于VP2蛋白多肽的C端,且被其包裹在内,这可能影响了病毒样颗粒的形成,表明,PPV VP2基因3'端不适合外源基因插入构建重组病毒样颗粒.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒pEGFP-NSP9的构建与表达

为验证siRNAs对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制效果,构建了猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因与增强型绿色荧光蛋白基因GFP的融合表达质粒,并在Marc145细胞中进行了表达。通过RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因,将其克隆入表达载体pEGFP-N1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染Marc145细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和NSP9基因转录水平。结果显示,经双酶切及PCR鉴定,目的基因的大小与预期相符。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有NSP9基因的转录。本研究成功构建的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP9基因GFP融合表达质粒,为在细胞水平快速筛选有效的siRNAs提供了工具。     

猪细小病毒SC-1株VP2基因的定点突变及其对该基因表达的影响

根据GenBank中的猪细小病毒(PPV)VP2基因序列设计并合成了2对突变引物,对PPV SC-1株VP2基因进行了定点突变.利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建含报告基因EGFP的重组质粒pPI-2.EGFP.VP2(A)、pPI-2.EGFP.VP2(B);利用脂质体介导法将上述重组质粒转染COS-7细胞,从而研究该突变对VP2基因表达的影响.结果显示,成功构建了合突变体及EGFP的真核表达载体;在倒置荧光显微镜下,突变后的质粒转染呈现不同的荧光信号,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品与阳性对照相似,荧光信号均匀分布于细胞中.提示,突变的引入是导致表达差异的主要原因.     

旋毛虫Ts43基因真核表达载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

利用RT-PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因,并克隆入pcDNA3.1-CT-GFP真核表达载体中构建重组质粒,用该重组质粒在脂质体介导下转染Vero E6细胞,GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液样品中有1条约66 ku的条带,可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,说明,真核表达载体pcDNA3.1-CT-GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达,表达产物具有抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒P20及P14蛋白基因的表达及其产物的抗原性分析

将牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)p20和p14基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX-HTb,并转化至相应的宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)pLysS和DH5α中表达。P20蛋白在2个宿主中都获得了高效表达;P14蛋白在BL21(DE3)pLysS中表达量较低,而在DH5α中未见表达。对P14蛋白诱导表达过程的监测表明,P14蛋白对大肠杆菌是一种毒性蛋白。用Western-blotting分析未能检测到两种蛋白的反应条带,推测这两种蛋白可能存在构象表位。     

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物, 对CaPV P32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969 bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD／ Thio-TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPV P32基因序列的同源性高达99％;相应地,氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经 L-arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPV P32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约 51．53 ku。     

后危机时代俄罗斯经济发展悖论探析

由美国次贷危机所引发的世界金融危机对每一个国家的经济都产生了很大的冲击,俄罗斯也未能幸免。但金融危机的影响时效有多长,后危机时代经济发展的推动点何在,是许多国家所共同关注的问题。本文梳理了后危机时代世界经济的发展趋势与特征,对比了俄罗斯经济与世界经济的发展趋势,得出他们之间存在一定的悖论。     

R2P: “State of Play”

Abstract

Is R2P the most effective tool the international community has to prevent genocide, or the newest neo-imperial norm perpetuated by the most powerful states? In a dramatic performance of the key debates within R2P, each of these views is presented before Aristotlean and Tocquevillean insights are drawn upon to find a middle ground rooted in citizen resistance against mass atrocity crimes. R2P can both become a more effective tool of prevention and gain needed political legitimacy by drawing on the rich historical tradition of citizen resistance to empower local actors defying regimes engaged in mass atrocity crimes.     

山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFast-BacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测。结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别。     

猪脑心肌炎病毒P1和P12A3C基因重组腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫应答

为研制脑心肌炎病毒(EMCV)新型活载体疫苗,首先将病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中,构建得到了重组穿梭质粒pDC316-P1和pDC316-P12A3C。将其分别与辅助质粒pBHGloxΔE1、3Cre共转染293细胞,成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。免疫过氧化物酶单层试验确证,重组腺病毒可表达目的蛋白。分1次和2次肌肉注射免疫小鼠,然后通过间接ELISA试验和中和试验评价其诱导的特异性体液免疫水平。结果,Ad-P1诱导的VP1特异总抗体IgG水平显著高于Ad-P12A3C,但不能检测到明显的中和抗体(<1∶8);Ad-P12A3C能诱导产生良好的中和抗体(1∶32~1∶128),用1×108TCID50剂量EMCV BJC3株攻毒,Ad-P12A3C免疫组能获得100%的保护,而Ad-P1免疫组仅能获得部分保护。以上结果表明,Ad-P12A3C可作为良好的EMCV腺病毒活载体疫苗。     

非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达

根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法从ASFV DNA中分别扩增出了P54基因片段和经过改造的跨膜信号肽缺失的P54基因,将其克隆到表达载体pET28b中,构建了重组质粒pET-P54和pET-P54q,测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Western-blotting检测.结果显示,经过改造的信号肽缺失的重组菌pET-P54q可表达出分子质量约24.5 ku的重组融合蛋白,表达的蛋白以可溶形式存在于菌体中,经镍柱亲和层析纯化可获得纯度较高的目的蛋白.纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证实,表达的蛋白具有较好的反应原性.     

牛霉形体免疫相关性蛋白P51的筛选与鉴定

为了筛选免疫原性蛋白,建立牛霉形体的快速诊断方法,利用二维凝胶(2-D)电泳、Western-blot分析及蛋白质谱分析,筛选出一个免疫相关性蛋白P51。以牛霉形体中国分离株Hubei-1为模板,扩增了p51基因,并克隆到原核表达载体pET32a上。结果显示,重组蛋白pET32a-p51与牛霉形体阳性血清的Dot-blotting试验结果为阳性,而Western-blotting试验结果为阴性。以pET32a-p51重组蛋白为包被抗原的ELISA试验表明其能与自然感染和人工感染牛霉形体的阳性血清发生特异性反应,而与灭活疫苗免疫的阳性血清不发生特异性反应,与牛传染性胸膜肺炎的阳性血清没有交叉反应。表明P51可能是牛霉形体特有的一种构象依赖性免疫相关蛋白,是一种有前景的诊断用抗原。     

重庆市山羊博尔纳病病毒P24基因的检测

为了解重庆市山羊博尔纳病隐性带毒情况,分析博尔纳病病毒(BDV)的种系来源。采用巢式逆转录酶PCR结合荧光定量PCR(FQ-nRT-PCR)技术对重庆市60只山羊外周血单核细胞 (PBMCs)及脑组织中的BDV P24基因片段进行了检测,将阳性产物测序,并与国外BDV毒株进行了比较。结果,山羊外周血检测阳性率为8．3％(5／60),脑组织检测阳性率为10％(6／60)。该 BDV P24片段核苷酸序列与马源BDV H1766株同源性最高,达96．51％,与标准株Strain V和 He／80同源性为95．35％,并且编码的氨基酸序列也相同。表明,重庆市山羊中存在动物源性博尔纳病隐性带毒。该BDV P24核苷酸序列与Strain V和He／80株具有高度同源性。