鸡IFN-γ重组鸡痘病毒对鸡传染性腔上囊炎MB43弱毒疫苗免疫鸡免疫应答的影响

将重组鸡痘病毒(rFPV-IFN-γ)与IBD MB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡,研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响.结果显示,rFPV-IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rFPV-IFN-γ)及rIFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组(MB43+rIFN-γ)在免疫后第2周即可检出ELISA抗体,比MB43疫苗单独免疫组早1周.用IBDV Gx株攻击后,MB43+rFPV-IFN-γ组和MB43+rIFN-γ组免疫鸡的脾只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解,少数滤泡萎缩变性坏死;胸腺损伤程度轻于MB43疫苗单独免疫组和非免疫对照组.免疫后1周,3个免疫组外周血CD8+T淋巴细胞含量均显著高于非免疫对照组,CD4+T淋巴细胞含量变化不明显;攻毒后第2周,3个疫苗免疫组CD4+、CD8+T淋巴细胞含量均显著升高,各组之间CD4+、CD8+T淋巴细胞含量无明显差异.证实,rFPV-IFN-γ和rIFN-γ可加强疫苗的细胞免疫和体液免疫应答.     

IBDV感染对T细胞趋化因子受体及其配体基因表达的影响

传染性腔上囊病毒(IBDV)感染家禽过程中,大量外源T细胞迁移到靶器官腔上囊组织,造成家禽严重的免疫抑制,本试验主要为了弄清影响T细胞定向迁移的关键因子。本试验利用IBDV感染SPF鸡动物模型,收集IBDV感染后第1和3天的腔上囊、胸腺和脾组织,利用定量PCR技术来测定T细胞趋化因子受体相关基因表达水平。结果显示,感染对照组中CCR4、CCR5、CCR6和CCR7基因表达水平明显升高,与健康对照组差异显著(P0.01),IBDV感染后第1天趋化因子受体基因表达水平比第3天高;CXCR4基因表达水平先升高后降低,变化明显;同时腔上囊组织中CCR5和CCR7的配体CCL4和CCL19基因表达水平也显著升高。结果表明,CCR5/CCL4、CCR7/CCL19轴可能参与T细胞迁移至腔上囊的过程,从而对IBDV的致病性产生重要作用。     

IBDV感染鸡免疫器官淋巴细胞中细胞凋亡调控蛋白的动态表达

用鸡传染性腔上囊病病毒(IBDV)SNJ93株、BC6/85株、B87株感染SPF鸡后观察免疫器官淋巴细胞中Bcl 2和Bax蛋白的分布定位和动态变化。结果,B87株接种组的腔上囊、脾、胸腺淋巴细胞中这两种蛋白在各检测时间均为阴性反应;SNJ93与BC6/85攻毒组胸腺淋巴细胞中这两种蛋白呈现阴性反应,SNJ93攻毒组腔上囊和脾淋巴细胞在48h即开始出现Bcl 2和Bax阳性反应,腔上囊淋巴细胞内这两种蛋白在感染后72、96、120h呈现明显的强阳性反应,以后开始降低,脾淋巴细胞中这两种蛋白在感染后72、96h出现强阳性反应;BC6/85攻毒组腔上囊淋巴细胞中只在96、120h出现阳性反应,脾淋巴细胞中只在96h呈现阳性反应。用免疫组化法检测Bax和Bcl 2,有可能为IBDV毒力划分增添新的依据。     

同胚接种IBDV和NDV制造二联弱毒苗

用鸡传染性腔上囊病病毒 (IBDV)和新城疫病毒 (NDV)接种同一鸡胚收取种毒 ,试制IBDV、NDV二联弱毒冻干疫苗 ,安全性和效力检验均达到这 2种单苗《规程》规定的标准 ,证明 2种病毒在鸡体内产生互不干扰抗体     

鸡TLR2信号通路中相关分子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立鸡Toll样受体2(ChTLR2)信号通路中相关分子的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank中TLR2信号通路中的5种相关分子即ChTLR2-1,ChTLR2-2,ChTLR6,鸡骨髓分化蛋白88(ChMyD88)及鸡核因子κB(ChNF-κB)基因序列,以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(ChGAPDH)基因为参考基因,设计特异引物扩增目的基因片段。将6种基因克隆至pMD8-T载体后得到各自的阳性克隆质粒,以6种阳性质粒为标准品建立了标准曲线并进行熔解曲线分析以及灵敏性、特异性和重复性试验分析。应用建立的方法对堆形艾美耳球虫核酸疫苗pcDNA/Ea3-1E免疫SPF雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA的转录水平进行检测。结果显示,当标准品稀释度为1×102～1×1010copies/μL时,6种基因Ct值与浓度间具有良好的线性关系,相关系数均大于0.995。熔解曲线分析表明,产物为特异性单峰且重复性较好。免疫雏鸡脾中ChMyD88和ChNF-κB mRNA转录水平的检测结果表明,免疫组2种分子mRNA转录水平均极显著高于空白对照组(P<0.01)。本研究为ChTLR...     

感染传染性法氏囊病病毒的DF-1细胞中chTLR3表达的动态变化

为研究鸡Toll样受体3(chTLR3)基因在传染性法氏囊病病毒(IBDV)感染DF-1细胞过程中的表达情况,用3种不同毒力的IBDV感染DF-1细胞,采用实时荧光定量PCR法以及间接免疫荧光法对细胞内chTLR3基因的表达情况进行了检测。结果显示,DF-1细胞感染IBDV标准株后,其chTLR3mRNA的表达量呈增长趋势,感染后第48小时mRNA表达量达到峰值(P0.01),之后逐渐下降;DF-1细胞分别感染IBDV弱毒疫苗株与分离株后,其chTLR3mRNA表达量均出现先上升后下降的趋势,但其表达量低于标准株(P0.01)。采用间接免疫荧光法检测的chTLR3蛋白的表达变化规律与其基因的表达变化规律相同。结果证实,chTLR3参与IBDV感染DF-1细胞的过程;IBDV的毒力可影响chTLR3的表达。     

ELISA检测鸡传染性法氏囊病的免疫抗体动态变化

鸡传染性法氏囊病(IBD)病毒侵害携带SIgM标志的B淋巴细胞,导致感染鸡的体液免疫功能不全,引起免疫抑制,增加对其它病原体的易感性。现已构成集约化养鸡业的一大威胁。用弱毒疫苗预防IBD时,较高的母源抗体水平能干扰疫苗的作用,因此,免疫效果取决于接种疫苗日龄的选择。这就要求有敏感而快速的检测抗体方法。本试验应用ELISA方法定量检测雏鸡血清抗体水平。结果表明,目前大多数鸡场母源抗体只能保护1周龄幼鸡抵抗IBDV感染。雏鸡应在第2周龄接种IBD疫苗。(一)材料与方法     

PCV2感染对猪MCP-1和IL-8 mRNA表达的影响

将猪圆环病毒2型(PCV2)BF株经口、鼻接种40日龄健康普通仔猪,于接种后不同时间宰杀,收集肺泡巨噬细胞(PAM),同时设立对照。用竞争PCR技术测定趋化性细胞因子IL-8和 MCP-1 mRNA水平,分析PCV2感染对其mRNA表达的影响。结果显示,与对照组相比,在 PCV2感染后第7 d,IL-8 mRNA水平下降至最低,随后迅速上升,至第14 d时达到高峰,而后快速下降,但仍维持较高水平;MCP-1 mRNA水平在攻毒后第3 d下降至最低,之后逐渐上升,至第14 d时达到高峰,而后下降,第21 d以后恢复正常。结果表明,PCV2感染初期可导致PAM趋化性细胞因子IL-8和MCP-1基因的转录明显下调。     

鸡传染性腔上囊病超强毒致弱株疫苗的研制

以国内分离的鸡传染性腔上囊超强毒(vvIBDV)G株的致弱株Gt为种毒研制疫苗,实验室免疫效力试验和安全性试验表明,该疫苗对雏鸡的最适免疫剂量为50万PFU/只,免疫后7 d开始产生抗体,14 d时抗体阳转率为100%,对强毒攻击的保护率为100%以500万PFU/只的剂量免疫雏鸡,不引起腔上囊病的临床症状和病理变化,对雏鸡安全可靠;现地应用证明,对肉用鸡免疫一次可保护至其出栏.     

鸡新城疫Ⅰ系疫苗诱导鸡胚IFN-γ基因转录及cDNA克隆的研究

应用反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)技术 ,从鸡新城疫I系疫苗接种的洛阳土种鸡胚脾提取的RNA中扩增到干扰素 γ(IFN γ)基因cDNA。结果表明 ,以 1∶5 0或 1∶10 0稀释度接种后第 4 8h提取的mRNA扩增效果最佳。序列测定显示 ,所克隆的洛阳土种鸡IFN γ基因cDNA与所报道的鸡IFN γ基因cDNA同源性为 99.7% ,相应的氨基酸序列同源性为 10 0 % ,说明鸡IFN γ基因编码区高度保守。     

绵羊血浆中氟甲喹及其代谢产物7-羟基氟甲喹浓度的RP-HPLC测定

利用C8色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm),以V(乙腈)∶V(15 mmol/L KH2PO4)缓冲液=39∶61为流动相,在320 nm紫外光下,利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定了绵羊血浆中氟甲喹及其代谢产物7-羟基氟甲喹的浓度。结果显示,氟甲喹和7-羟基氟甲喹分别在20~10 000 ng/mL和20~500ng/mL范围内线性关系良好(r=0.999和r=0.998),平均绝对回收率分别为84.3%±6.7%和67.5%±5.6%,日内与日间精密度均小于8.3%,最低检测限均为10 ng/mL;内源性物质不干扰测定。表明,RP-HPLC的工作曲线稳定,灵敏度高,操作步骤简单,可用于绵羊血浆中氟甲喹及其代谢产物7-羟基氟甲喹浓度的测定和药动学考察。     

非洲马瘟病毒VP7基因在重组杆状病毒中的表达及抗原性检测

利用pFastBacHTA质粒将非洲马瘟病毒(AHSV)血清4型的VP7基因重组入杆状病毒,并感染昆虫细胞Sf9。结果显示,VP7蛋白在真核细胞内获得了表达,但表达量较低。免疫印迹试验证实,VP7重组蛋白具有较好的免疫原性,将其作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测AHSV的间接酶联免疫吸附试验方法。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T-HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒(AIV)HA1基因,并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1,与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经3次蚀斑纯化,得到重组杆状病毒rpBlueHisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示,HA1在昆虫细胞中得到表达,且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明,重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明,重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

牛IgG2 Fc受体在COS-7细胞表面的稳定表达

将牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)编码区cDNA亚克隆到真核表达载体pcDNA3的巨细胞病毒启动子下游,构建了重组表达质粒pc3bo2R;以重组质粒转染COS-7细胞,用玫瑰花环试验检测boFcγ2R在转染细胞表面的表达,通过G418抗性筛选和连续克隆化,在转染细胞表面稳定表达了boFcγ2R受体分子,转染细胞的玫瑰花环形成率达90%。最后获得稳定表达boFcγ2R受体分子的COS-7转染细胞系,为受体的功能研究提供了良好的技术平台。     

禽流感病毒H7亚型血凝素基因的原核表达及鉴定

参考已发表的禽流感病毒 (AIV)H7亚型血凝素 (HA)基因序列设计引物 ,经RT PCR扩增了AIV H7亚型的HA1基因片段 ,再将该片段定向插入到原核表达载体 pGEX 4T 2中 ,转化大肠埃希氏菌。重组表达载体经酶切和测序鉴定后 ,用IPTG诱导表达。用Western blotting和ELISA试验鉴定表达产物的抗原性。结果表明 ,融合表达蛋白能与AIVH7N1、H7N2、H7N7和H1N1亚型标准抗血清反应 ,而与H5N1、H9N 2等其他 13个亚型的抗血清无交叉反应。     

柔嫩艾美球虫间接ELISA检测方法的建立

将已构建的原核表达载体pET Mzp5 7在大肠埃希氏菌中诱导表达 ,以融合重组蛋白为包被抗原 ,以HRP标记的鼠抗鸡IgG为二抗 ,建立了检测柔嫩艾美球虫抗体的间接ELISA方法。经筛选 ,该方法的最佳反应条件是 :λMzp5 7重组蛋白最佳包被量为 1.0 μg/孔 ,10 0mL/L胎牛血清封闭 ,二抗的最佳工作浓度为 1∶16 0 ,用正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。结果表明 ,建立的间接ELISA方法可用于监测柔嫩艾美球虫抗体 ,且具有快速、简便、成本低等优点     

猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析

将北京地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ） 分离株ＢＪ２ 和ＢＪ４ 的ＯＲＦ ７ 及部分３’端非编码区（ ＵＴＲ） 的ＲＴＰＣＲ 扩增产物克隆连接于ｐ ＧＥＭＴｅａｓｙ 质粒载体上,重组质粒经ＥｃｏＲ Ⅰ酶切鉴定后进行了双链测序。测定的基因序列与欧美标准毒株已知序列比较发现,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与美洲ＶＲ２３３２ 株非常接近,在其长度为５５５ ｂｐ 的ｃＤＮＡ 序列中,仅与ＶＲ２３３２ 株分别相差１ 和２ 个核苷酸,其中ＯＲＦ ７ 的核苷酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别高达１００ ％ 和９９ ．４６ ％ ,其推导的氨基酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别为１００ ％ 和９９ ．２５ ％ ,３’ＵＴＲ 则完全相同;而与欧洲ＬＶ 株则有明显差异,其核苷酸序列同源性仅为６８ ．００ ％ 和６７ ．００ ％ ,推测的氨基酸序列同源性仅有６５ ．００ ％ 和６４ ．００ ％ ,且ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与ＬＶ 株相比缺失了ＫＫＳＴＡＰＭ 和ＡＳＱＧ 两段氨基酸序列,而３’ＵＴＲ 则比ＬＶ 株多出３８ ｎｔ 的一段特征性核苷酸序列。序列分析结果表明,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株属于同一基因型,且具有ＶＲ２３３２ 株的基因特点     

致病性大肠杆菌O_(157):H_7基因分型的研究进展

就目前的大肠杆菌O157:H7基因分型方法进行了综述,将其归纳为3类:基于DNA的限制性酶切技术、基于特异靶标的PCR扩增技术、基于基因组特定位点的DNA多态性分析技术,阐述和分析了这些技术所涉及的方法和技术特点。认为,大肠杆菌O157:H7具有重要的公共卫生学意义,开展流行病学调查和病原溯源追踪是防控大肠杆菌病的重要手段,而基因分型是大肠杆菌O157:H7鉴定和示踪的重要技术。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达。提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体。