IBDV H1株VP2基因的原核表达及其产物的复性

应用RT-PCR技术从传染性腔上囊病病鸡总RNA中克隆出1 461 bp的VP2基因,将其克隆于pET-28a载体,筛选并构建了pVP2表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3) 中成功表达了53．7 ku的蛋白,SDS-PAGE和Western-blotting分析结果显示,VP2表达产物以包涵体形式存在,可与鸡IBDV抗血清及1株IBDV单抗发生特异性反应。将VP2表达产物进行纯化和复性,用复性前后的蛋白分别与特异性多抗进行Dot-ELISA检测,结果,复性后蛋白的反应活性比复性前增强了10倍;用复性后的蛋白与IBDV单抗进行Dot-ELISA,结果显示,VP2蛋白与单抗1H4、1E12、583、EA6、3C7反应强( );与4E4、1H11反应中度( );与4E5、3C4、 1E11、3H9反应较弱;而与EC6、3D12、1A1无反应。     

塞内加谷病毒VP1蛋白的表达纯化及鉴定

为表达并纯化塞内加谷病毒(Senecavirus A,SVA)的VP1蛋白,克隆SVA的VP1基因,测定其序列并构建遗传进化树,分析VP1蛋白氨基酸突变位点并预测其二级结构。然后将VP1基因克隆至载体pET-32a(+)中,IPTG诱导表达VP1重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱纯化并用W estern-blot进行验证。结果显示,表达的VP1重组蛋白的大小为48 ku,主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的单克隆抗体发生特异性免疫反应。结果表明成功表达并纯化出VP1重组蛋白。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。     

猪白细胞介素-6基因在大肠杆菌中的表达及其产物的促淋巴细胞增殖活性

为研究猪白细胞介素-6(IL-6)作为免疫佐剂的可行性,用IPTG诱导含有猪IL-6基因的BL21(DE3)LysS工程菌,表达的目的蛋白经超声波破碎,洗涤,8mol/L尿素变性溶解后,用固化金属亲和层析法纯化后用谷胱甘肽再氧化还原法进行复性,并用MTT法对复性的重组蛋白的生物学活性进行分析.结果显示,复性的重组猪IL-6具有良好的刺激淋巴细胞体外增殖的活性.说明重组猪IL-6在作为免疫佐剂方面有一定的应用价值.     

大肠埃希氏菌表达FMDV 3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌 ,高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV 3AB非结构蛋白进行纯化 ,经SDS PAGE分析 ,3AB融合蛋白纯度达 90 %以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性 ,通过Westernblotting分析 ,表明复性后的 3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明 ,复性后的 3AB融合蛋白有很好的抗原活性。     

基于VP0蛋白的用以检测1型鸭甲肝病毒抗体的间接ELISA的建立和应用

为检测1型鸭甲肝病毒(DHAV1)抗体,在大肠杆菌中表达获得了DHAV1的重组VP0蛋白,以纯化复性的重组VP0蛋白为抗原建立检测DHAV1抗体的间接ELISA(VP0-ELISA)。其最佳反应条件为:以1.67μg/mL重组VP0蛋白37℃孵育1h后4℃包被过夜;50g/L明胶封闭0.5h;被检血清1∶160稀释,37℃孵育1h;HRP标记的山羊抗鸭IgG进行1∶400稀释,37℃孵育1h;TMB避光显色10min,测定D450nm/D630nm值,阳性阈值为0.375。该方法具有较强的灵敏性、特异性和重复性。用建立的间接VP0-ELISA对60份鸭血清样本进行检测,与以DHAV1作为包被抗原的ELISA相比,阳性检出率为92.3%,阳性符合率为90.0%。上述结果表明,基于VP0蛋白的间接ELISA可用于临床DHAV1抗体的检测和流行病学调查。     

重组牛IFN-α对亚洲Ⅰ型口蹄疫亚单位疫苗免疫小鼠的影响

在大肠杆菌BL21(DE3)中分别表达了牛IFN-α基因、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)VP1和VP1 C末端基因,并纯化了所表达的蛋白。用透析的方法进行蛋白复性后制成油乳剂疫苗,经皮下多点注射免疫小鼠,以MTT法检测小鼠脾淋巴细胞经植物血凝素(PHA)刺激后的增殖反应活性;以液相阻断ELISA检测血清FMDV特异抗体的变化。结果表明,重组VP1(rVP1)和rVP1 C末端蛋白能单独诱发小鼠的体液免疫反应和微量的细胞免疫反应,而与重组牛IFN-α(rBoIFN-α)共同接种的小鼠,体液免疫反应和细胞免疫反应更为明显。     

鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其对应抗原表位区的分析

为获得抗鹅细小病毒(GPV)VP1蛋白的单克隆抗体,以纯化的VP1蛋白为免疫原,免疫4～6周龄的雌性BALB/c鼠,经4次免疫后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,共获得5株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株。Western-blot结果表明,这5株杂交瘤细胞分泌的抗体均能特异地与纯化后的GPV-VP1重组蛋白发生反应,单克隆抗体亚型鉴定结果表明,3株单抗为IgG1亚型,1株单抗为IgG2b亚型,1株单抗为IgA亚型,轻链均为κ链。用单克隆抗体对分段表达的VP1蛋白进行免疫印迹分析,结果鉴定出3个抗原表位识别区,分别位于VP1的第92～123、92～145和111～145aa。证实,这5株杂交瘤细胞在体外长期培养能稳定地分泌抗GPVVP1的单克隆抗体。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV) C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法,获得了可溶性的纯化蛋白E2,其纯度达70%,回收率为10%。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测,结果表明,其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因和牛α-干扰素基因的融合表达

将AsiaⅠ型口蹄疫病毒YNBS/58株VP1基因和去信号肽的牛α-干扰素基因共同亚克隆于原核表达载体 pET-28a中,转化 BL21 后经 IPTG诱导,实现了重组融合蛋白 VP1-BoIFN -α在大肠埃希氏菌 BL21 中的高效表达,表达产物经 SDS-PAGE 和 Western blotting 分析,重组的VP1-BoIFN-α蛋白分子质量约为 46 ku,与预期大小相符。薄层扫描分析显示,重组蛋白 VP1-BoIFN-α的表达量占菌体总蛋白的30%,且以包涵体的形式存在。包涵体提取物用 8 mol/L尿素溶解后,在变性条件下利用Ni-NTA柱对VP1-BoIFN-α融合蛋白进行了纯化。     

口蹄疫病毒的纯化及鉴定

通过PEG 6 0 0 0沉淀 ,差速离心和蔗糖密度梯度离心等方法提取纯化了口蹄疫完整病毒粒子 (FMDV ) ,经 30g/L磷钨酸负染后电镜观察 ,FMDV 14 6S为中心黑染的圆形颗粒 ,与中心透亮的FMDV空衣壳有明显区别 ,SDS PAGE和Western blotting试验结果表明 ,FMDV 14 6S电泳出现VP1、VP2、VP3三条结构蛋白带 ,其中VP1和VP3与阳性血清发生反应出现 2条明显的条带。     

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。     

传染性法氏囊病病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体间接ELISA检测方法,本研究首先将VP2基因分3段(部分序列重叠),分别为VP2(1~600)、VP2(376~975)和VP2(751~1350),并根据大肠杆菌对密码子的偏爱性进行优化,将优化的3个VP2基因片段分别克隆于原核表达载体pET28a(+)中,转化E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western-blot,结果3个重组VP2蛋白均获得了表达。用纯化的3个重组VP2蛋白rVP2(1~600)、rVP2(376~975)和rVP2(751~1350)分别作为包被抗原,建立了IBDV抗体间接ELISA(rVP2-ELISA)。用rVP2-ELISA、IDEXX-ELISA(IBDV)及中和试验对96份临床血清样本进行检测,结果显示,3个重组VP2蛋白建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法、IDEXX-ELISA(IBDV)与中和试验比较,相对敏感性分别为97.1%、61.8%、58.8%和100%;相对特异性分别为85.5%、82.3%、83.9%和25.8%;符合率分别为89.6%、75.0%、75.0%和52.08%。本研究为研制IBDV抗体间接ELISA检测试剂盒(以重组VP2蛋白作为包被抗原)奠定了基础。     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测塞内卡病毒VP2蛋白的间接ELISA方法,本试验将A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了筛选。结果显示,VP2蛋白包被量为2μg/m L(1∶1000稀释);用2%BSA封闭液稀释标准阳性血清为1∶20;二抗做1∶5000稀释;TMB底物显色液室温避光显色反应10 min。特异性试验结果显示,同FMDV、PRRSV、CSFV、PRV和APP阳性血清均无交叉反应。此方法对塞内卡病毒阳性血清的敏感性为1∶160。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本分别进行间接荧光抗体免疫方法和间接ELISA方法的检测,结果符合率为95.5%。上述结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。     

抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

利用已构建好的pET-30a重组菌E.coli Rosetta(DE3)表达鹅细小病毒(GPV)VP3重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后作为免疫原,经腹膜腔接种4～6周龄BALB/c小鼠3次,末次免疫后第3d取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。用建立的间接ELISA方法进行筛选,经4次亚克隆,最终获得4株能稳定分泌抗GPVVP3单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1F1、2A9、3B11和4A2。亚类鉴定结果显示,单抗1F1为IgG2b亚型,其余3株单抗为IgG1亚型,轻链均为κ链。经间接ELISA检测,单抗1F1、2A9、3B11和4A2的腹水效价分别为1:819200、1:1638400、1:409600和1:819200。Western-blot分析表明,获得的4株单克隆抗体均能特异性识别GPVVP3重组蛋白;间接免疫荧光试验证明,这4株单抗能够与天然GPV结合。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。