基于昆虫细胞表达的鹅细小病毒VP3蛋白的VP3-ELISA诊断方法的建立

将鹅细小病毒EP22株VP3基因克隆到杆状病毒转移载体pFast-Bac-HTB中,酶切鉴定及测序筛选出阳性重组转座载体pFastBac-VP3,转化至含有杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-VP3,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得到含鹅细小病毒VP3基因的重组杆状病毒rBV-VP3。经SDS-PAGE、Western-blot以及免疫组化试验证实,VP3基因在Sf9细胞中成功表达。利用表达的VP3蛋白建立VP3-ELISA血清学检测方法并对130份鹅血清样品进行检测,以中和试验作为金标准进行对比试验。结果显示,VP3-ELISA检测方法的特异性为100%,敏感性为96.2%,并且VP3-ELISA与其他鹅病阳性血清间不出现交叉反应性。上述研究结果表明,本研究建立的VP3-ELISA是一种特异的、灵敏的血清学诊断方法。     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因重组犬2型腺病毒的构建

应用PCR方法扩增出亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒的VP1基因,继而构建出真核表达载体pVAX-VP1。再将含有巨细胞启动子CMV的目的基因表达盒连接到穿梭载体pVAX△E3上,筛选出VP1表达盒方向与E3区转录方向一致的重组子,获得转移载体。再经酶切,连接等方法获得重组腺病毒质粒。利用脂质体介导将重组质粒转染DK细胞,转染3次后,细胞出现明显的腺病毒病变。经PCR扩增、测序检测及基因组酶切鉴定,证明该病毒即为重组犬2型腺病毒。命名为CAV2/FMDV。经验证,该重组毒可稳定遗传,其毒价为103.5TCID50/mL。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达.     

鹅细小病毒VP2基因原核及真核表达载体的构建

将鹅细小病毒VP2基因克隆到原核表达载体 pPROEX HTb及真核转移载体pFASTBAC HTb中 ,重组真核转移载体在DH10BAC 中经转座作用 ,成功构建了表达VP2基因的原核表达载体pPROEX HTb VP2和杆状病毒表达载体BAC VP2。经限制性内切酶酶切及PCR分析 ,确定为阳性重组子     

重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌表达质粒的构建及表达

本试验通过构建重组A型FMDV VP1基因减毒鼠伤寒沙门菌,诱导产生外源蛋白,为减毒鼠伤寒沙门菌作为FMDV VP1口服活载体疫苗可行性提供研究基础。将A型FMDV VP1基因克隆后测序,根据减毒鼠伤寒沙门菌的密码子偏好性进行优化,再将其插入表达载体p YA3341之中构建重组质粒p YA3341-VP1。然后,将构建的重组质粒p YA3341-VP 1采用化学法转入大肠杆菌X6212中,筛选阳性克隆。经PCR鉴定和双酶切鉴定正确后,将重组质粒p YA3341-VP1依次转入减毒鼠伤寒沙门菌中间宿主X3730和表达宿主X4550中,在转入X4550后第3.5小时加入IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE与Western-blot分析。结果表明,成功构建了重组减毒沙门菌X4550-VP1载体,且表达产物大小为23 ku,与预期目的蛋白大小相符。上述结果表明,FMDV VP1基因在减毒鼠伤寒沙门菌中得到了成功表达。     

口蹄疫病毒多基因片段的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

根据定点突变原理获得了包含口蹄疫病毒P1、2A、3C、3D及部分 2B编码区的目的基因片段 ,经SpeⅠ和HindⅢ双酶切后 ,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体 pFastBacHT连接 ,得到了重组质粒 pFB P12X3C3D。经酶切和测序鉴定后 ,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac ,经抗性及蓝白斑筛选 ,得到了含P12X3C3D多基因的重组穿梭载体 ,将其命名为Bacmid P12X3C3D ;提取其DNA并转染Sf9昆虫细胞 ,最后获得含口蹄疫病毒P12X3C3D多基因的重组杆状病毒。     

A型口蹄疫病毒多抗原表位杆状病毒表达载体的构建及表达

为构建A型口蹄疫病毒(FMDV)多抗原表位杆状病毒表达载体,将A型FMDV上5个B细胞表位(VP1140-160aa、VP270-80aa、VP352-67aa、3B29-42aa和3D16-30aa)和4个辅助性T细胞表位(VP1200-213aa、VP420-34aa、3A21-35aa和3D346-370aa)通过人工合成的方法串联起来构建复合多表位基因B。然后将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac HTB。将酶切和测序鉴定正确的阳性重组质粒pFastBac HTB-B转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将PCR鉴定正确的重组杆状病毒质粒利用CellfectinⅡReagent转染至Sf9细胞。通过间接免疫荧光试验和Western-blot检测表达情况。结果显示,能够得到与A型FMDV猪抗阳性血清结合的蛋白,大小约为22.3ku,与预期结果相符。结果表明,成功构建了A型FMDV多抗原表位杆状病毒表达载体,并在昆虫细胞中正确表达,为下一步蛋白纯化奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Min-A株糖蛋白gE基因真核表达质粒的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒 (PRV)Rice株的 gE基因序列设计了 1对引物 ,用PCR法特异性地扩增出了PRVMin A株的 gE基因 ,并克隆到 pUC19中 ,再与杆状病毒转座质粒pFastBac1连接得到 pFastBac gE ,pFastBac gE转化穿梭载体Bacmid ,得到了重组rBacmid gE表达载体     

口蹄疫病毒O/China/99株VP1基因植物种子特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDVVP1的核苷酸序列设计并合成引物,从种子特异性启动子7S质粒pU82质粒中扩增7S启动子,经HindⅢ和BamHⅠ酶切,与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接,经酶切、PCR鉴定及序列分析,种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDVVP1基因的pGEMVP1质粒中扩增VP1基因,经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后,与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接,经酶切、PCR及测序鉴定,FMDVVP1基因已置于种子特异性启动子7S下游,成功构建了FMDVVP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438VP1。通过三亲交配法,将表达载体p7SBin438VP1导入根癌农杆菌,为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。     

鸡贫血病毒VP1、VP2和VP3基因酵母双杂交载体的构建及其自激活活性的鉴定

为构建鸡贫血病毒(CAV)VP1、VP2、VP3基因酵母双杂交载体并鉴定其自激活作用,从CAV细胞传代毒M9905毒株中提取基因组DNA,利用PCR分别扩增VP1、VP2和VP3基因,采用Gateway技术将VP1、VP2和VP3基因分别克隆到酵母双杂交载体pDEST32和pDEST22中,构建了诱饵载体及猎物载体,经酶切和PCR鉴定且测序正确后,用醋酸锂法转化酵母菌株Mav203,通过缺陷型平板SD/-Leu/-Trp/-His和SD/-Leu/-Trp/-Ura筛选以及LacZ报告基因检测载体有无自激活作用。结果表明,成功构建了诱饵载体pDEST32-VP1/VP2/VP3和捕获载体pDEST22-VP1/VP2/VP3,并证明其VP1、VP2和VP3蛋白在酵母双杂交系统中无自激活作用。研究结果为下一步利用酵母双杂交系统探索CAVVP1、VP2、VP3蛋白之间的相互作用奠定了基础。     

脑心肌炎病毒VP1结构蛋白的可溶性表达及鉴定

为获得可溶性表达的脑心肌炎病毒(EMCV)结构蛋白VP1片段,将EMCV VP1基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,并转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中。采用不同温度、不同IPTG浓度及不同诱导时间诱导目的蛋白表达,以筛选VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件,并通过Western-blotting检测最佳条件下表达蛋白的免疫活性。PCR、酶切鉴定及测序结果表明,VP1基因已克隆入pGEX-4T-1质粒。经优化,确定VP1融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当D600nm值为0.4～0.6时,以0.25mmol/L IPTG于25℃条件下诱导表达12h。Western-blotting结果显示,诱导表达的蛋白具有免疫活性。     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒 pT VP4和 pT VP7中扩增VP4、VP7基因 ,连接至 pGEM 5zf(+ )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒 pET 2 8a(+ ) ,连接、转化受体菌 ,经PCR、酶切和序列分析证明 ,连接向位和阅读框架是正确的 ,从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体 pET2 8a VP4、pET2 8a VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下 ,用SDS PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明 ,表达的目的蛋白以包涵体的形式存在 ,蛋白的分子量分别为 37.6 9和 36 .2 0ku ,表达量占菌体总蛋白的比例分别为 17.1%和 14 .4 %。     

轮状病毒VP4蛋白与热稳定肠毒素融合基因的克隆及其植物表达载体的构建

利用DNA重组技术,将用PCR扩增来的 VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体 pBin438 中,成功构建了重组表达质粒 pTh-VP4-ST和 pB-VP4-ST。将pTh-VP4-ST进行SDS-AGE分析,结果表明,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,大小约 40ku;同时将pB-VP4-ST转化了农杆菌EHA105。     

番鸭细小病毒MDPV YZ株VP2和VP3蛋白基因的克隆和序列测定

根据国外已发表的番鸭细小病毒(MDPV)FM株基因组核苷酸序列设计了1对引物,应用PCR技术扩增了MDPV YZ株的VP2和VP3蛋白基因片段.将扩增后的VP2和VP3蛋白基因克隆到pCR 3.1 T载体上,MDPV YZ株基因大小为1764 bp,编码528个氨基酸,并对插入片段进行序列测定.测定结果表明,我国分离的MDPV YZ株蛋白基因序列与国外发表的序列的同源性为98.5%.     

猪瘟病毒E2基因和牛疱疹病毒Ⅰ型UL49基因的共表达

为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响,构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3.1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3.1-E2-UL49。将pcDNA3.1-E2与pcDNA3.1-E2-UL49分别转染293 T细胞,间接免疫荧光试验结果显示,单独表达E2蛋白的细胞,其荧光主要固缩于核周,而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光;Western-blot分析结果显示,VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达,但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些(P<0.01),表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。     

禽脑脊髓炎病毒 VP3基因的克隆与序列测定

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒 (AEV)序列设计了 1对引物 ,利用RT PCR技术 ,从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑以及内脏器官组织中成功扩增出了VP3基因 ,回收、纯化后克隆到T载体中 ,用常规方法转化JM1 0 9感受态细胞。阳性重组质粒经酶切及PCR鉴定后测定核酸序列。结果表明 ,VR株VP3基因全长 73 5bp ,共编码 2 4 5个氨基酸 ,与AEV 1 1 4 3标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为 93 .0 %和 97.0 % ;并将其与其他小RNA病毒进行了比较     

禽脑脊髓炎病毒VR株衣壳蛋白基因的克隆及序列分析

用冻存的禽脑脊髓炎病毒VanRoekel(AEVVR)株通过SPF鸡胚传代复壮 ,获得了试验用病毒株样本。根据已知禽脑脊髓炎病毒 114 3(AEV 114 3)株的衣壳蛋白VP0、VP3、VP1基因序列 ,设计了 3对引物 ,分别扩增AEVVR株的VP0、VP3、VP1基因 ,将RT PCR产物进行分子克隆和序列分析。结果表明 ,AEVVR株与AEV 114 3株VP0、VP3、VP1基因的核苷酸同源性分别为 95 .1%、93.6 %和 93.9% ;氨基酸的同源性分别为 97.5 %、97.5 %和 99.6 %。     

鹅细小病毒NS2基因以及VP1与VP3非重叠序列基因的真核表达

采用pBlueBacHis2A系统筛选鹅细小病毒(GPV)的检测抗原,利用PCR扩增和双酶切方法分别构建了含有NS2基因和VP1与VP3非重复序列基因的重组质粒pBlueBacHis2A-GPV-NS2、pBlueBa-cHis2A-GPV-VP(1-3),分别转染sf9细胞,得到重组病毒,分别表达出了54 ku的NS2融合蛋白和24 ku的VP(1-3)融合蛋白。Western-blotting和Dot-ELISA检测结果证实,表达产物具有特异性;间接免疫荧光试验证实,重组蛋白在细胞中获得了表达。     

口蹄疫病毒OH株结构蛋白基因VP1的克隆与表达

采用RT-PCR方法扩增获得了O型口蹄疫病毒的主要免疫原VP1基因,将其插入pMD18-T载体进行序列分析,结果表明,所获得的基因片段含有完整的FMDV结构蛋白VP1编码区。根据表达载体pQE-Trisystem的克隆位点序列和该VPl基因片段的末端序列设计了1对表达引物,以重组pMD-T-VP1阳性质粒为模板,扩增获得了VP1基因,通过酶切将其克隆至表达载体pQE-Trisystem上。经测序证实,重组表达质粒所含的外源基因VP1编码框正确无误。将重组表达质粒pQE-VP1转化至大肠埃希氏菌M15,通过IPTG诱导促使VP1基因高效表达,SDS- PAGE和Western-blot分析表明,表达产物大小与预期的结果(26 ku)一致,且具有良好的反应原性。以2 mmol／L IPTG诱导表达5 h时表达量最高,其中70％-80％的目的蛋白存在于菌体裂解后的上清中,表明外源基因VP1主要以可溶性方式表达。