鸡传染性支气管炎北京地方株S_1基因的克隆与鉴定

利用反转录套式聚合酶链反应（ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ）技术从北京地区３株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分离株（ＢＪ１,ＢＪ２,ＢＪ３）中扩增出１０５４ｂｐＳ１基因高变区。利用限制性内切酶ＳｉｎⅠ和ＰｓｔⅠ的酶切位点分析图谱进一步证实了ＲＴｎｅｓｔｅｄＰＣＲ的特异性。将３段Ｓ１基因分别克隆到ｐＵＣ１９质粒中,获得重组质粒ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ１,ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ２和ｐＵＣＩＢＶＳ１ＢＪ３。     

减蛋综合征病毒基因组DNA的酶切分析

采用差速离心法纯化了鸭胚尿囊液中的减蛋综合征（ＥＤＳ－７６）病毒ＷＰＤＶ２０５株并提取了病毒基因组核酸。选用ＥｃｏＲⅠ和ＢａｍＨⅠ两种限制性内切酶分别对病毒基因组ＤＮＡ进行单酶切和双酶切处理，单酶切消化均产生４个片段，双酶切消化产生７个片段。用琼脂糖凝胶电泳方法测定了病毒基因组ＤＮＡ和所有酶切片段的分子质量。将这些结果与ＡＶ－１２７标准株和Ｂ８／７８株基因组ＤＮＡ由相同的内切酶消化的结果进行比较，发现该株病毒基因组ＤＮＡ的片段数目、大小与ＡＶ－１２７标准株和Ｂ８／７８株基因组ＤＮＡ的大致相同，但具有双酶切位点的较小片段的长度略有不同     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲型标准毒株（ＡＴＣＣＶＲ－２３３２）的ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７的序列,设计合成了一对引物２６３７４ＰＳ／２６３７５ＰＲ,用反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）技术对６株ＰＲＲＳＶ北京分离株进行了检测。结果该引物对６株病毒均能扩增出与预期大小相符的ＲＴＰＣＲ产物,并与ＡＴＣＣＶＲ２３３２株扩增产物的大小相当,而欧洲型标准毒株（ＬＶ株）未获扩增片段。进一步用限制性内切酶进行酶切分析,发现这６株病毒及ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的ＰＣＲ产物皆出现相同的限制性酶切图谱,证实６株病毒均为ＰＲＲＳＶ。     

新城疫病毒F_(48)E_8株血凝素-神经氨酸酶基因的克隆与鉴定

应用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）获取新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因。扩增反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析，长约１．９３ｋｂ，与预期结果相符。将其克隆入质粒载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）中，经限制性内切酶分析和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实为新城疫病毒Ｆ４８Ｅ８株的血凝素－神经氨酸酶基因     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因的扩增及酶切分析

以从内蒙古区分离的 2株传染性喉气管炎病毒 (ILTV)株的DNA为模板 ,用设计好的 1对引物对这 2株毒株的 gB基因进行了PCR扩增 ,并对扩增产物分别用BglⅡ、PstⅠ、HindⅢ限制性内切酶酶切分析。结果表明 ,2个分离株均能特异性地扩增出该病毒 gB基因片段 ,片段大小完全一致 ,为 2 .6kb ;扩增产物的酶切图谱与参考株完全一致。     

鸭源和鸡源减蛋综合征病毒的多肽分析

减蛋综合征（ＥＤＳ）病毒属禽腺病毒,虽然其血清型只有１种,但用限制性内切酶试验可将大量病毒分离物分为３组基因型。基因型不同,则由核酸翻译成的蛋白质也会存在差异。我们已证实鸭源ＥＤＳ病毒ＪＥ１株和鸡源ＥＤＳ病毒ＮＥ４株属不同的基因型。本试验利用ＳＤＳ?..     

猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析

将北京地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ） 分离株ＢＪ２ 和ＢＪ４ 的ＯＲＦ ７ 及部分３’端非编码区（ ＵＴＲ） 的ＲＴＰＣＲ 扩增产物克隆连接于ｐ ＧＥＭＴｅａｓｙ 质粒载体上,重组质粒经ＥｃｏＲ Ⅰ酶切鉴定后进行了双链测序。测定的基因序列与欧美标准毒株已知序列比较发现,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与美洲ＶＲ２３３２ 株非常接近,在其长度为５５５ ｂｐ 的ｃＤＮＡ 序列中,仅与ＶＲ２３３２ 株分别相差１ 和２ 个核苷酸,其中ＯＲＦ ７ 的核苷酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别高达１００ ％ 和９９ ．４６ ％ ,其推导的氨基酸序列与ＶＲ２３３２ 株同源性分别为１００ ％ 和９９ ．２５ ％ ,３’ＵＴＲ 则完全相同;而与欧洲ＬＶ 株则有明显差异,其核苷酸序列同源性仅为６８ ．００ ％ 和６７ ．００ ％ ,推测的氨基酸序列同源性仅有６５ ．００ ％ 和６４ ．００ ％ ,且ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株与ＬＶ 株相比缺失了ＫＫＳＴＡＰＭ 和ＡＳＱＧ 两段氨基酸序列,而３’ＵＴＲ 则比ＬＶ 株多出３８ ｎｔ 的一段特征性核苷酸序列。序列分析结果表明,ＢＪ２ 和ＢＪ４ 株属于同一基因型,且具有ＶＲ２３３２ 株的基因特点     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

重组和构建了新城疫病毒（ＮＤＶ）融合蛋白基因，并对该基因进行了鉴定。结果显示，将ＮＤＶＦｘ基因片段经ＲＴＰＣＲ扩增，插入经ＥｃｏＲⅠ和（或）ＳａｌⅠ酶切克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９株。用氨苄青霉素平板法初步筛选克隆，双酶切法、核酸探针、ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定后，表明插入成功且阅读框架正确。     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列,应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２,分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ－）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南１和云南２分离株进行了ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增均产生４５７ｂｐ的特异性片段,而ＴＫ－ＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ片段;用引物ＰＢ１和ＰＢ２对７株ＩＢＲＶＤＮＡ及ＴＫ－ＩＢＲＶＤＮＡ进行扩增均产生３３９ｂｐ的特异性片段;用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增,均未见特异性条带,从而证明该引物是特异的;ＰＣＲ的敏感性检测表明,该法可检测出３ｐｇ的病毒ＤＮＡ。所建立的方法可以鉴别野毒与ＴＫ－ＩＢＲＶ疫苗毒的感染。     

以PCR为基础的分子生物学方法及其在寄生虫学方面的应用

扼要介绍了以聚合酶链反应（ＰＣＲ）为基础的随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）,ＰＣＲ连接的限制性酶切片段长度多态性（ＰＣＲＲＦＬＰ）,扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）等和ＤＮＡ序列分析在寄生虫学方面的应用及其优势和不足;叙述了检测寄生虫序列变异的几种新方法     

鸡病毒性关节炎JN－1株疫苗的免疫研究

将鸡病毒性关节炎病毒（ＡＶＡＶ）Ｊ－１株经一系列培养和蚀斑克隆，筛选出一株蚀斑大小为２．７～３．１ｍｍ的克隆株（ＪＮ－１株）。该株分别以１０￣（５·７２５）ＴＣＩＤ＿（５０）足掌皮下注射和１０￣（４·７２５）～１０￣（６·７２５）ＴＣＩＤ＿（５０）肌肉注射１日龄肉鸡，以５×１０￣（６·７２５）ＴＣＩＤ＿（５０）肌肉注射肉用种鸡，均不产生任何临床症状和病理变化；在敏感雏鸡体内传代５次和鸡胚细胞内传代１０次，无毒力返强现象。雏鸡的最低免疫剂量为１０￣（３·７２５）ＴＣＩＤ＿（５０），抗体持续时间达９个月以上。用ＪＮ－１株免疫１日龄肉用雏鸡后７、１４、２１和２８天分别用强毒于足掌皮下攻击，临床保护率分别为２／１０、９／１０、１０／１０、１０／１０，病理保护率分别０／１０、７／１０、９／１０、１０／１０。抗体应答反应和特异性淋巴细胞转化试验证明，ＪＮ－１株的免疫作用是由细胞免疫和体液免疫共同完成。体外中和病毒试验显示，ＪＮ－１株抗血清能中和Ｊ－１、Ｓ＿（１１３３）、ＦＤＯ和Ｈ＿（９３０７）株。在５个有疫情的肉用种鸡场共免疫２８０００余只仔鸡和种鸡，免疫后再无ＡＶＡ疫情发生。     

限制性内切酶分析技术在细菌诊断中的应用

(一)细菌限制性内切酶分析原理 限制性内切酶是细菌产生的一类防范外测DDNA酶,它可以识别DNA上的特异位点,并从该点将DNA分子切断,各种限制酶的识别位点不同,对不同DNA分子可以切出大小及数目不同的片段,如果大小相同的两个DNA分子,其酶切片断相同,则可以判断它们完全或几乎相同,如两种或更多种限制酶均切出相同的片段,则     

伯氏疏螺旋体鞭毛基因的PCR单链构象多态性分析

应用多聚酶链反应单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）技术分析了甘肃地区伯氏疏螺旋体和国际标准株Ｂ３１的鞭毛基因，发现甘肃不同宿主的２株伯氏疏螺旋体的鞭毛基因是一致的，属同一型螺旋体，而与Ｂ３１株明显不同，证明甘肃地区分离株与Ｂ３１株在鞭毛基因上不属同一型螺旋体。     

3株减蛋综合征病毒毒株核酸酶切图谱分析

选用EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、PvuⅡ、BglⅠ、SmaⅠ和PstⅠ等8种限制性内切酶,对不同地区分离的3株减蛋综合征(EDS)病毒进行酶切图谱比较.结果发现3株毒用前6种酶切割后产生的片段数及各片段的大小均相同,而用SmaⅠ和PstⅠ切割后,贵州分离毒HS-1与国际标准毒AV-127、南京分离毒GC2相比,多出1个片段.表明不同地区EDS分离毒的核酸结构基本相同而又略有差异.     

抗兔轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用小鼠骨髓瘤细胞（ＳＰ２／０）与经兔轮状病毒（ＬａＲＶ）免疫的ＢＡＬＢ／ｃ。系小鼠脾细胞进行融合，融合成功率为２２％。经间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）和斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）筛速杂交瘤细胞，阳性率为２９％左右。对其中６株强阳性的杂交瘤细胞进行了亚克隆，获得高产亚克隆杂交名细胞，用ＢＡＬＢ／ｃ小鼠生产了腹水，鉴定后选取２株强阳性高效阶的杂交瘤细胞，以ＥＬＩＳＡ阻断试验检验其分泌抗体的特异性，以直接ＥＬＩＳＡ测其敏感性，用琼脂双扩散试验鉴定类和亚类型别。结果１Ｂ＿３为ＩｇＧ，，２Ｂ＿４为ＩｇＧ＿（２ｂ）。     

鸡传染性喉气管炎病毒中国王岗株糖蛋白gB基因克隆及鉴定

以ＰＵＣ１９质粒为载体构建了鸡传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）ＥｃｏＲＩＤＮＡ文库。根据已经发表的澳大利亚ＩＬＴＶ－ＳＡ２株和英国ＩＬＴＶ－Ｖ８２２株的糖蛋白ｇＢ基因的核苷酸序列，设计并合成了一对引物，以ＩＬＴＶ中国王岗株ＤＮＡ为模板，扩增出１．３３８ｋｂ的糖蛋白ｇＢ基因片段，用ＤＩＧ标记制备成核酸探针，从ＩＬＴＶＥｃｏＲＩＤＮＡ文库中筛选出阳性重组子，得到一个ＥｃｏＲＩ３．０ｋｂ的ＩＬＴＶＤＮＡ片段。经酶切分析表明，该３．０ｋｂＩＬＴＶＤＮＡＥｃｏＲＩ片段含有完整的糖蛋白ｇＢ基因，经ＰＣＲ和核酸杂交表明所克隆的糖蛋白ｇＢ基因是特异的。     

应用PCR-RFLP分析鉴别广西鸡毒霉形体

针对鸡毒霉形体 (MG) 16S和 2 3SrRNA基因间的高变区序列设计合成了 1对引物 ,对MG菌株进行了PCR扩增 ,获得了 1条 899bp的DNA片段 ,而其他禽病病原DNA无扩增。扩增产物经用限制性内切酶AfaⅠ和DraⅠ进行酶切片段长度多态性分析 ,表明各MG菌株酶切图谱间均存在差异。     

抗鸡传染性法氏囊病病毒单克隆抗体中和株的建立

将纯化的鸡传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）组织毒免疫的ＢＡＬＢ／ｃ鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，用ＥＬＩＳＡ、病毒中和试验检测分泌抗体，获得了６株稳定分泌抗ＩＢＤＶ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞，命名为ＮＩＢ－１，ＮＩＢ－２，ＮＩＢ－３，ＮＩＢ－４，ＮＩＢ－５，ＮＩＢ－６；６株ＭｃＡｂ均具ＥＬＩＳＡ特性和免疫沉淀特性，亚类鉴定表明，前４株属于ＩｇＧ_（２ａ），后２株属于ＩｇＧ_１。杂交瘤细胞冻存６个月后复苏，均能稳定分泌特异性ＭｃＡｂ。     

水貂肠炎病毒疫苗株和野毒株PCR-RFLP鉴别方法的建立

为了建立水貂肠炎病毒(MEV)疫苗株与野毒株的鉴别检测方法,根据GenBank中的水貂肠炎病毒序列设计了1对引物,用来扩增包含水貂肠炎病毒NS1基因在内的2 013bp大小的片段。通过对国内疫苗毒MEVB株及其他细小病毒参考株的NS1基因序列比较发现,疫苗毒MEVB株NS1基因核苷酸1401位的碱基由T变为C,致使1399位～1404位的核苷酸构成由ATTGAT变异为ATCGAT,多了1个限制性内切酶ClaⅠ酶切位点,其他MEV分离毒株中均未出现此酶切位点。用特异性引物扩增出2 013bp的目的片段后,再用限制性内切酶ClaⅠ进行酶切分析,疫苗毒MEVB株被切割成1 404bp和609bp的2个片段,国内其他分离株均未出现上述片段。结果表明,所建立的PCR-RFLP方法可以区分疫苗毒MEVB株和野毒株。     

猪瘟病毒遗传发生关系分析

利用反转录（ＲＴ）及ＰＣＲ扩增并测定了中国猪瘟兔化弱毒（Ｃ－株）兔组织毒、Ｃ－株细胞疫苗毒和近期（１９９７～１９９８年）甘肃省７个地区的１０个流行野毒株的Ｅ２基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：Ｃ－株兔组织毒、Ｃ－株细胞毒和中国５０～６０年代流行的石门强毒株同属于组群１（Ｇｒｏｕｐ１）;近期猪瘟流行毒株同属于组群２（Ｇｒｏｕｐ２）的两个不同的亚组群（Ｓｕｂｇｒｏｕｐ２．１和２．２）,其流行毒株与疫苗毒株有较大的差异（Ｅ２全基因核苷酸序列同源性８２．２％～８４．３％）,表明猪瘟流行毒株向远离疫苗毒株的方向演变。