禽呼肠孤病毒σNS基因的克隆及其功能分析

采用RT-PCR技术对8株禽呼肠孤病毒(ARV)σNS基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与pMD18-T载体连接。测序结果表明,所构建的克隆质粒中均含有相应的σNS蛋白基因,大小为1 107bp。经DNAStar软件分析,除R1株外,其他ARV毒株的σNS基因核苷酸及其推导氨基酸序列与标准毒株S1133和1733株的同源性很高。Antheprot 5.0蛋白分析软件的分析结果表明,σNS蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,可作为诊断候选蛋白。     

禽呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增了禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株与广西分离株R2σNS非结构蛋白基因,将σNS基因克隆到质粒表达载体pGEX-4T-1上,获得的重组质粒经PCR、酶切鉴定以及测序分析,σNS基因的插入位置、大小和阅读框均正确,将阳性克隆命名为pGEX-S1133-σNS和pGEX-R2-σNS。构建好的重组质粒经37℃1 mmol/L IPTG诱导、SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,显示目的蛋白以包涵体方式表达,其蛋白质分子质量约为66.2 ku,约占菌体总量的31.5%~34.8%。Western-blotting分析表明,目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有较好的抗原性。     

鸡病毒性关节炎病毒C-98分离株S1基因的克隆与序列分析

提取鸡病毒性关节炎病毒(AVAV)内蒙古分离株(C-98株)总RNA,参考GenBank中禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株S1基因序列设计了2对引物,应用RT-PCR技术扩增了病毒S1基因,将S1基因cDNA克隆到pGEM-T Easy载体后测序。将测定序列拼接后与参考毒株ARV-176、ARV-138、ARV-S1133、MDRV-YJL的S1基因序列进行了比较。结果显示,AVAV C-98分离株的S1基因与强毒株ARV-176株的同源性最高,达99.9%;与MDRV-YJL的同源性为99.3%,与弱毒疫苗株ARV-S1133的同源性也达97.9%;与ARV-138株的同源性最低,为81.2%。表明,AVAV C-98株与参考毒株的差异较小,与疫苗株ARV-S1133有很高的同源性。     

禽呼肠孤病毒S1133株在LMH细胞系中增殖特征的研究

为研究禽呼肠孤病毒(ARV)在鸡肝癌细胞(LMH)中的增殖特性,本研究将ARV S1133毒株感染LMH细胞,连续传代3次,观察细胞病变(CPE),通过RT-PCR鉴定病毒,并进一步研究病毒的增殖特性。结果显示,ARV S1133毒株能够在LMH细胞中很好地增殖,并出现典型的CPE。一步生长曲线结果显示,S1133感染LMH细胞后的前12 h为潜伏期,12 h~24 h为快速增长期,第24小时的效价达到最大,TCID50为10-9.2/0.1 m L。本研究为进一步研究ARV的致病机理和研制细胞灭活疫苗提供了良好的操作平台。     

禽呼肠孤病毒感染鸡胚成纤维细胞后三种细胞因子基因mRNA转录水平的动态变化

为了分析禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株感染鸡胚成纤维细胞(CEF)对细胞产生的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影响,并探讨禽呼肠孤病毒的感染机制及病毒与宿主之间的作用关系,运用实时荧光定量RT-PCR技术,测定和分析了ARV-S1133感染CEF细胞后ARV结构蛋白σC和IL-1β、IL-6、TNF-α的动态转录水平。结果显示,ARV-S1133感染CEF后第10小时起病毒σC基因mRNA的相对表达量开始迅速上升,在第48小时达到最高峰(13 162.73倍);ARV-S1133感染后引起CEF中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量发生变化,这3个基因mRNA的表达变化趋势相似。IL-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA转录水平在感染早期迅速上升,在感染后第6小时达到第1个峰值,随后下降,在感染中后期再次显著上升,在第48小时达到第2个峰值。IL-1β、IL-6、TNF-α在感染后第6、24、36和48小时的mRNA转录水平与对照组差异极显著(P0.01)。结果表明,ARV感染后可诱导CEF分泌IL-1β、IL-6、TNF-α的水平上调,进而发生炎症反应,说明IL-1β、IL-6、TNF-α可能与禽呼肠孤病毒的复制和致病机制相关。     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒(ARV)P17非结构蛋白基因完整开放阅读框(ORF)的特异性引物,对ARV S1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0.2 mmol/LIPTG诱导,表达的融合蛋白分子质量为42.4 ku,占菌体总蛋白的34%。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后,纯度达到85%。Western-blotting显示,纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应,说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

二重微滴式数字PCR定量检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体方法的建立

为绝对定量检测禽呼肠孤病毒（avian reovirus,ARV）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae,MS）,本研究建立了二重微滴式数字PCR(ddPCR)。根据已发表的ARV S1基因和MS的VlhA基因序列保守序列,分别设计了针对S1和VlhA基因的特异引物和探针,通过优化引物和探针的浓度及反应条件后,建立了二重ddPCR定量检测ARV和MS方法,并对建立方法的特异性、敏感性和重复性进行测试。结果显示,优化后最佳的引物和探针浓度分别为1.2和0.35μmol/L,最佳退火温度为55℃。特异性检测结果只检出ARV和MS,没有检出其他对照的禽病病原。敏感性检测结果显示,该方法检测ARV及MS重组质粒DNA的检出限分别为微滴数6.3和5.4 copies/μL,检测方法的检出限与单重ddPCR最低检出限相同,敏感性比荧光定量PCR方法高10倍。对3个连续稀释的ARV和MS重组质粒DNA检测结果的变异系数均小于5%,重复性好。对92份病鸡关节囊、喉拭子及肺样品进行检测,二重ddPCR方法检出12份样品呈ARV阳性,9份样品呈MS阳性,其中2份样品呈ARV和MS阳性,A...     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组(S1-4)中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明:鸭呼肠孤病毒(DRV)与禽呼肠孤病毒(ARV)的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76.0%~77.1%和78.4%~79.6%,氨基酸同源性分别为89.5%~91.2%和91.6%~92.7%;而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60.3%~64.4%和2.7%~9.9%,氨基酸同源性分别为61.4%~62.0%和22.6%~26.7%;DRV和ARV抗原性存在差异。而DRV S12/S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90.0%、93.6%、87.9%~88.0%和93.1%,氨基酸同源性分别为97.1%、94.3%、95.7%~95.9%和93.7%。进化树分析表明,DRV与ARV形成不同的分支,DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

禽呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

采用RT-PCR方法扩增禽呼肠孤病毒(ARV)99G株σB编码基因,序列分析表明,99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90%～99 9%,而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60%;用BarnH Ⅰ和Xho Ⅰ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-σB;鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,σB基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白的41.46%,融合蛋白的分子质量为66 ku,主要以包涵体形式存在;Western-blot结果显示,该融合蛋白能与抗ARV阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性,可用于禽呼肠孤病毒病诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制.     

禽呼肠孤病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立禽呼肠孤病毒(ARV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,将PCR扩增的σC基因片段克隆到pGM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定、SalⅠ单酶切,得到线性化转录模板DNA,将体外转录的RNA梯度稀释后作为阳性模板,用于标准曲线的制定。根据S1基因σC结构蛋白基因保守区域序列设计了1对特异性引物,以体外转录的RNA作为标准品,应用SYBR GreenⅠ染料法建立了检测ARV的一步法实时荧光定量RT-PCR方法。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,制作的标准曲线定量浓度范围宽,比常规的RT-PCR敏感1×103倍,可检测到5.2×102个拷贝的标准品RNA,与NDVI、BDV、MG均不反应;从攻毒鸡的关节组织中可以检测到病毒,病毒含量为1×105~1×107个拷贝/μL。表明,建立的实时荧光定量RT-PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于ARV的检测。     

比格犬甲状腺显微与超微结构的观察

应用光镜和透射电镜技术,观察了3~6月龄比格犬甲状腺的显微和超微结构。结果表明,比格犬甲状腺实质由滤泡和滤泡旁细胞构成。滤泡呈圆形或椭圆形,直径20.22~220.00μm,平均90.80μm;由单层立方上皮细胞围成,细胞高度3.04~7.11μm,平均5.18μm,电镜下可见功能状态不同的两型滤泡上皮细胞;滤泡旁细胞很多,直径4.40~8.82μm,平均6.23μm,位于滤泡之间或镶嵌于滤泡上皮细胞之间,也可聚集在一起形成滤泡样结构,胞质内含有大量的分泌颗粒,电镜下也可见两种类型的滤泡旁细胞。     

柬埔寨:2010年回顾与2011年展望

2010年,柬埔寨社会稳定、经济稳步发展,在对外关系上奉行独立、和平、永久中立和不结盟的外交政策,虽然柬埔寨与泰国时为边境领土问题爆发冲突,但柬埔寨政府能稳妥处理。     

日本经济安全保障理论辨析

日本是对经济安全问题研究比较早的国家之一,形成了独具特色的经济安全保障理论。在日本的经济安全保障理论中,关于什么是经济安全保障以及经济安全保障与军事安全保障、综合安全保障、人类安全保障的关系等问题,在不同的时代产生了各种各样的观点,对此要进行综合地辨析,才能真正理解日本的经济安全保障理论,从而能够更好地理解日本安全保障政策。     

三聚氰胺对小鼠急性毒性试验中消化系统重要组织器官损伤的病理学观察

为探讨三聚氰胺对急性毒性试验中小鼠的胃、小肠和肝的损伤作用,将32只SPF级昆明小鼠随机分为4组,每组8只,雌雄各半,连续灌服不同剂量的三聚氰胺(0、175、350、700 mg/kg),观察试验小鼠的临床表现,剖检死亡小鼠并取材,观察胃、小肠和肝的病理学变化。结果显示,各试验组小鼠48 h内均全部死亡。光镜下可见死亡小鼠胃和小肠的黏膜层弥漫性坏死,肝细胞脂肪变性,肝小叶弥漫性淤血,甚至有片状出血灶,灶内肝细胞坏死。700 mg/kg组小鼠的胃、小肠及肝血管内均可见多个黄色颗粒状结晶体沉着。在透射电镜下,175 mg/kg和350 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆结构疏松,线粒体肿胀,700 mg/kg组小鼠的肝细胞胞浆中充满脂滴,线粒体弥漫性固缩。表明,三聚氰胺可引起小鼠胃肠黏膜发生急性弥漫性坏死,肝淤血,肝细胞变性,散在坏死,高浓度的三聚氰胺可在胃、小肠和肝间质中形成结晶体。     

乳牛L-选择素在中性粒细胞中表达与分布的定位研究

采用间接荧光标记及胶体金标记方法通过流式细胞仪和低压扫描电子显微镜,检测了L-选择素在健康泌乳中期乳牛(A组)及患金黄色葡萄球菌型临床型(B组)和亚临床型乳腺炎乳牛(C组)中性粒细胞上表达的基本规律。结果表明:三者表达L-选择素的中性粒细胞阳性率分别为97.90%、97.69%和96.67%(收集5 000个细胞),组间差异不显著(P>0.05),但患亚临床型乳腺炎乳牛的阳性率从3次测定的结果看是逐渐增加的;L-选择素表达的间接荧光强度组间差异极显著(P<0.01);而患亚临床型乳腺炎的乳牛组内差异也极显著(P<0.01);扫描电镜观察到的中性粒细胞表面脊样结构的分布及形态与流式细胞仪检测的结果具有相似性。     

旋毛虫新生幼虫cDNA文库的构建

为了克隆和研究旋毛虫新生幼虫功能性抗原基因,采用酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取新生幼虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA及第二链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与载体λZAP Express连接.体外包装后得到中国猪旋毛虫(Trichinella spiralis)分离株新生幼虫cDNA文库.文库容量为2.0×106,重组率为98.6%,插入片段长度在0.4×103-2.0×103bp.     

少孢节丛孢菌超微结构的观察研究

观察了捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的超微结构,以探讨捕食线虫性真菌的杀虫机理。结果显示,少孢节丛孢菌属于隔膜类真菌,隔膜中央有孔,菌丝细胞一般呈长形竹节状;菌株的捕食器为黏性菌环和菌网,形成捕食器的菌丝细胞结构不同于一般的营养菌丝,胞质中含有许多电子密集体,呈大小不等的黑色类圆形颗粒状,多数排列在捕食器菌丝细胞的边缘区域,这是捕食线虫性真菌捕食器菌丝细胞的一个重要特征。     

云南省红河州山羊流产病原的调查

针对红河州山羊妊娠期流产严重的现象 ,进行了流行病学调查、临床症状观察、病理学检查、实验室诊断、人工感染试验和治疗试验。结果发现 ,妊娠母山羊流产现象覆盖全州 ,且流产率以每年 11.5 0 %的速度递增 ,弓形虫抗体阳性率为 30 .82 % (12 10 / 392 5 ) ,衣原体抗体阳性率为32 .31% (12 6 8/ 392 5 ) ,其中弓形虫和衣原体双重感染阳性羊占 9.35 % (36 7/ 392 5 ) ,未检出布鲁氏菌抗体阳性羊 ;自流产胎儿肺抹片中发现弓形虫滋养体包囊 ,7份流产胎儿中有 6份分离到衣原体 ;用土霉素及复方新诺明治疗有明显效果 ;人工感染试验能复制出与自然病例相同的病例模型。调查结果表明 ,红河州广泛流行的山羊妊娠期流产的病原是弓形虫、衣原体 ,2种病原单一感染或混合感染是造成流产的主要原因。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻(BVD)鉴别诊断ELISA方法,采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段,分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上,获得了重组质粒pGEX-6P1-p80A、pGEX-6P1-p80B和pGEX-6P1-p80C,将其分别转化感受态菌Rosetta和BL21,经1.0 mmol/L的IPTG诱导,分别得到大小为60、47和51 ku的目的蛋白。经Western-blotting分析,3个目的蛋白中,只有p80B(289~477 aa)基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应,表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

朝鲜的核、导战略态势及其影响

朝鲜实施导弹发射和地下核试验,意在实现核拥有,籍以提高对美战略的筹码。朝鲜开展核战略角逐由来已久,先后展开过以守为攻;“边缘”对应;将计就计;以硬对强四个回合。角逐结果虽不乏战术上的小胜,却丧失了战略上的大胜。此番的导弹试射与地下核试验可视为第五个回合,是朝鲜核、导角逐战略“以攻为守”的转换。朝鲜执意实现核拥有纵有多种原因,却因核、导本身所拥有的“双刃剑”作用,带来于己、于他都不利的负面影响。包括:自食其言,愈加难以取信于国际社会;产生连锁反映,引发新一轮的军备竞赛;挑战核不扩散条约,难免遭到更大封杀;破坏合作气氛,延缓统一进程;置中国于尴尬境地,动摇中朝关系基础。朝鲜的“自行其事”难免遭到国际社会更加严厉的抵制。