鸡毒霉形体H3株TM-1基因与鸡白细胞介素2基因串联子在大肠杆菌中的共表达

运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒霉形体H3株TM-1基因进行串联,插入到pET-30a( )质粒的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点间,经PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,表明已成功构建了含鸡毒霉形体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因,将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a( )-TM-1-IL-2。将此重组质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株。经IPTG 37℃诱导表达4 h后,SDS-PAGE电泳结果显示,此融合基因得到了表达,所表达出的融合蛋白的分子质量约为43 ku,主要以包涵体形式存在。表达产物在尿素存在下经超声波处理,获得了纯化的融合蛋白。这为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒霉形体的生物学活性奠定了基础。     

鸡毒霉形体TM-1基因原核表达载体的构建及表达

对从含有鸡毒霉形体H3株TM 1基因的大肠埃希氏菌DH5α中提取的质粒,进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,获得了大约为786bp的目的片段。将此片段与经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的线性原核表达载体pET 30a 1连接,转化宿主菌BL21(DE3),筛选阳性克隆。提取质粒,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入正确,从而构建成了重组表达载体。阳性克隆用IPTG诱导表达,表达产物经SDS PAGE电泳分析,证明其分子质量约为29ku;Western blotting分析表明,该蛋白可被鸡毒霉形体阳性血清识别,具有生物学活性。     

聚合酶链反应检测鉴别鸡毒霉形体强毒株和弱毒疫苗株的研究

根据鸡毒霉形体 (MG)强毒株和弱毒疫苗株基因组结构特点 ,分别设计合成 2对引物XZ1、XZ2 和XZ4 5、XZ4 6 ,建立了可检测MG强、弱毒株的PCR方法。以引物XZ1、XZ2 对MG强毒株和弱毒株进行的PCR ,均可扩增出 732bp的特异性片段 ;而以另 1对引物XZ4 5、XZ4 6 对MG弱毒株进行PCR ,可扩增出 5 2 4bp的特异性片段 ,但对鸡毒霉形体标准强毒株和野毒株的PCR ,则扩增不出任何条带。特异性试验表明 ,这 2对引物对其他种类鸡毒霉形体及其他对照禽病病原核酸模板的扩增均为阴性。敏感性试验结果显示 ,2对引物PCR均能检出 10 0fg的MGDNA。研究结果表明 ,通过上述 2对引物的 2次PCR扩增 ,在数小时内即可鉴别出MG毒株是强毒株还是弱毒疫苗株     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。     

猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性.     

鸡感染鸡毒霉形体和滑液霉形体情况的调查

鸡毒霉形体感染和滑液霉形体感染是世界养鸡业中两种主要霉形体感染。毕丁仁(1984)自北京和南宁两地分离的49株鸡源霉形体中有27株是鸡毒霉形体,2株滑液霉形体,说明国内养鸡场中也存在着这个问题。但是国内这两种霉形体感染情况,却未见报道。作者在各兽医生物药厂监察室同志协助下,对来自20个省、市自治区的21个地区的鸡血清进行了血清学反应检测,对这种感染情况获得初步的数据。     

副猪嗜血杆菌Neu基因的克隆表达及表达产物的免疫原性

为研究副猪嗜血杆菌(HPS)基因工程疫苗,以HPS5型毒株为模板,通过PCR扩增获得副猪嗜血杆菌神经氨酸酶(Neu)全基因,将其克隆至pMD18-T载体并对其进行测定和分析。结果表明,Neu全基因含一个2187bp的开放阅读框,编码一含729个氨基酸的蛋白,与Neu基因参考序列(登录号:NZ-ABKM01000006)的同源性为99.0%。以pMD-Neu基因为模板,重新设计引物,扩增得到HPSNeu蛋白的部分编码区,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建得到重组原核表达质粒pET-Neu。将pET-Neu在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行优化表达,经SDS-PAGE分析,重组蛋白Neu主要以包涵体形式表达,分子质量为52ku;Western-blot分析表明,重组蛋白Neu能与阳性血清发生特异性抗原反应。将纯化重组蛋白Neu试验性注射免疫昆明小鼠,攻毒试验结果显示,氢氧化铝佐剂组的保护性较低,仅有10%;而弗氏佐剂组具有较高的保护性,保护率高达60%。     

禽源CCL19蛋白的表达纯化和抗体的制备

为研究趋化因子CCL19在禽源疾病发生发展过程中的作用,利用RT-PCR技术,从攻毒后的鸡腔上囊组织克隆了禽源CCL19基因,测序结果显示,该基因ORF长300 bp,编码100个氨基酸,与Gen Bank中登录的禽源CCL19序列完全一致;将该基因亚克隆至原核表达载体p ET30a,IPTG诱导表达后,SDS-PAGE进行初步分析,在约13 ku处出现明显蛋白条带,与预期结果相符;经镍柱纯化后,获得了高纯度的重组融合蛋白,Western-blot分析显示,纯化后的重组融合蛋白能够与抗His标签单克隆抗体发生特异性反应。将纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔进行多克隆抗体的制备,经Western-blot检测,制备的抗体能与CCL19蛋白发生特异性反应。本研究首次克隆并表达了禽源CCL19蛋白,并对该蛋白进行了纯化和抗体的制备,该基因的成功克隆、表达和纯化以及针对目的蛋白抗体的制备,为进一步研究趋化因子CCL19在禽源疾病发生发展过程中的作用奠定了基础。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

猪乳转铁蛋白N端活性区的表达和多克隆抗体的制备

在采用亲和层析技术筛选猪嗜血霉形体表面黏附蛋白MSG1相关受体的过程中,发现猪乳转铁蛋白(LTF)可能是MSG1蛋白的潜在受体。为了对其受体功能进行确认,对截短的猪乳转铁蛋白进行了原核表达和多克隆抗体的制备。首先,以人工合成的猪乳转铁蛋白全基因为模板,通过PCR扩增猪乳转铁蛋白基因N端762个碱基后连接入pET-32a(+)载体中。其次,将重组质粒导入大肠杆菌BL-21感受态细胞中用IPTG进行蛋白诱导表达,对表达的重组蛋白用His单抗进行特异性鉴定,并对鉴定后的蛋白应用包涵体洗液进行纯化。最后,以纯化的蛋白通过背部多点皮内注射免疫小鼠和家兔制备多克隆抗体。结果,重组蛋白的分子质量在44ku左右,能够与His单抗发生特异性反应。Western-blot反应证明,制备的鼠和家兔多克隆抗体具有高度的特异性。猪乳转铁蛋白鼠和家兔多抗的制备为猪乳转铁蛋白受体功能的确认和激光共聚焦对其定位提供了技术储备。