口疮病毒XC13株的分离鉴定

采用MDBK细胞对西昌市某山羊场疑似患有口疮的山羊病料进行分离培养,经动物回归试验、PCR、遗传进化分析等对分离毒株进行鉴定。结果表明,病料在MDBK细胞上产生致细胞病变;接种病料的山羊出现典型的传染性脓疱;PCR从分离毒株中扩增出F1L基因片段,该基因片段序列与口疮病毒(ORFV)参考株FJ-SL2、FJ-SL1的核苷酸序列的同源性分别为99.8%、99.5%,亲缘关系较近,遗传进化分析处于同一分支上。本研究从疑似口疮病料中成功分离鉴定出1株口疮病毒,遂将其命名为ORFV XC13。     

14株基因C型鸭甲肝病毒分离株的VP1基因变异及其编码蛋白的抗原表位分析

对14株分离自四川不同地区的基因C型鸭甲肝病毒(DHAV-C)VP1基因进行了PCR扩增、测序、序列比对分析以及抗原表位分析。结果显示,14株DHAV-C VP1基因核苷酸序列的同源性为92.2%～100%,推导氨基酸序列的同源性为85.8%～100%,与GenBank中的24株DHAV-C VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.9%～99.3%和80.8%～100%。聚类分析显示,四川华阳地区分离的6株DHAV-C的VP1基因与黑龙江分离株Du/CH/LJS/090905同属一支,3株四川邛崃地区分离株与北京分离株C-GY及福建分离株FJ01同属一支,4株四川郫县分离株与1株四川邛崃分离株处于独立的小分支,它们与其他毒株之间存在一定的遗传距离。DHAV-C VP1蛋白由240个氨基酸组成,是由α螺旋、β折叠和无规则卷曲共同组成的混合型蛋白,VP1蛋白氨基酸序列的亲水性、抗原指数和表面可及性均较高,其中212～222位氨基酸区域的亲水性、抗原指数和表面可及性最高,可能是DHAV-C VP1蛋白上的B细胞表位优势区域,为DHAV-C表位疫苗的研究提供了理论依据。结果表明,四川分离株可能由于引种等原因从全国不同地区进入四川境内。     

羊口疮病毒F1L基因的克隆及其B细胞表位预测

为了研究羊口疮病毒(ORFV)F1L基因,以该病毒基因组DNA为模板,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增得到1011bp的F1L基因,将其插入pMD18-TEasy克隆载体,构建了F1L基因克隆重组质粒;再将该基因片段插入pGEX-6P-1表达载体,通过PCR、限制性内切酶双酶切和测序鉴定,得到F1L基因插入方向和读码框结构均正确的阳性质粒,表明,成功构建了羊口疮病毒F1L基因的重组表达载体。通过对F1L基因序列进行生物信息学分析,预测发现F1L蛋白亲水、无信号肽,B细胞表位主要位于第4～8位、第16～22位、第32～53位、第59～73位、第82～99位和第123～133位氨基酸。这将为建立ORFV诊断方法、制备单克隆抗体及合成肽疫苗奠定基础。     

羊口疮病毒B2L蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体,应用PCR扩增羊口疮病毒B2L基因并将其克隆到原核表达载体pET-30a进行表达。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。结果显示,获得了4株稳定分泌抗羊口疮病毒B2L蛋白的单克隆抗体细胞株,其抗体亚类均为IgG1。Western-blot鉴定结果和间接荧光抗体试验表明,4株单克隆抗体均能特异性识别羊口疮病毒。经鉴定,4株单克隆抗体细胞培养上清效价为1∶640~1∶1 280,腹水效价为1∶25×211~1∶25×212。染色体计数表明,4株杂交瘤细胞均是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物。结果表明,抗羊口疮病毒单克隆抗体的成功制备,为进一步研究羊口疮病毒的生物学特性及羊口疮快速诊断方法的建立奠定了基础。     

羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR鉴别检测方法的建立

针对羊痘病毒(capripoxvirus,CaPV)的A29L基因和羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的H3L基因,设计、合成了2对特异性引物以进行二重PCR。结果表明,该方法可以在数小时、在同一反应体系中清晰地区分CaPV和ORFV,其PCR产物大小分别为413 bp和708 bp,与预期的片段大小相符,序列分析证实目的基因序列与已发表的序列一致;该检测方法的灵敏度可达1个病毒蚀斑形成单位(PFU)。采用二重PCR对12株CaPV、ORFV和相关病毒、细菌培养物,以及22份田间样品进行检测,与预期结果完全一致,且与相关病毒或健康羊组织样品无交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可作为临床样品中CaPV和ORFV的鉴定和诊断的有效方法。     

口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。     

三株犬细小病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

为了解江苏省犬细小病毒(CPV)的流行变异情况,对疑似感染犬细小病毒的病例样品进行特异性PCR鉴定和F81细胞培养,并对病毒VP2基因及其推导氨基酸序列进行遗传变异分析。结果显示,成功分离到3株CPV,间接免疫荧光试验测定的病毒滴度分别为3.2×103TCID50/m L、3.5×103TCID50/m L、1.0×104TCID50/m L;3株CPV分离株VP2基因的核苷酸序列同源性为99.4%～99.8%,与30株来自不同国家和地区的CPV参考株同源性分别为98.1%～99.9%。VP2基因序列进化树显示,3株CPV分离株与CPV-2型(疫苗株)、CPV-2a型、CPV-2b型、New CPV-2a型、New CPV-2b型及国外CPV-2c型毒株的亲缘关系较远,与国内CPV-2c型毒株的亲缘关系较近;根据VP2蛋白第426位氨基酸位点的分子特征,证明这3株CPV分离株均为CPV-2c型毒株。该结果为近期江苏省CPV分子流行病学调查提供了依据。     

一株洞庭湖候鸟新城疫病毒的分离鉴定及基因组特征分析

为监测湖南省洞庭湖候鸟携带新城疫病毒的现状,本研究于2014年春季在湖南洞庭湖畔采集了150份候鸟粪便样品。经SPF鸡胚分离纯化和RT-PCR鉴定,获得1株新城疫病毒,命名为Swan/Hunan/123/2014(HuN,GenBank登录号:KT894018)。利用RT-PCR方法扩增了HuN株全基因组,并进行基因组序列测定。序列分析表明,HuN株基因组长度为15 186bp,编码的F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112 GK-Q-G-R-L117,符合新城疫经典弱毒株的分子特征。F基因相似性分析显示,其核苷酸序列与Queensland V4疫苗株、La Sota疫苗株和ZJ1毒株的同源率分别为99.8%、90.4%、81.3%。对HuN株的F基因、HN基因和全基因组遗传进化分析结果均显示,此毒株与Queensland V4株聚为一类,属于副黏病毒血清1型中的ClassⅡ类基因Ⅰ型新城疫病毒。     

H9N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其序列特征

用RT PCR技术扩增到H9N2亚型禽流感病毒分离株A/Chicken/Shanghai/F/ 98(简称F株 )的核蛋白 (NP)全基因。 18个毒株NP基因核苷酸序列比较结果显示 ,以Q/HK/G1/ 97为代表的、并和同期香港发生的人流感事件有直接联系的毒株相互间同源率达 98.3%～ 99.3% ,而F株与它们的同源率为 92 .2 %～ 92 .8%。遗传进化分析结果表明 ,F株独成一组 ,可暂时划分到类C/Ko/ 32 3/ 96亚系。从目前已发表的H9N2毒株NP基因数据不能确定F株的来源     

羊口疮病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立及应用

参照GenBank中登录的羊口疮病毒(ORFV)序列(Gu320351),针对OrfV的B2L基因保守区域设计了4条引物,通过优化反应条件,建立了检测OrfV的环介导等温扩增技术(LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,用建立的LAMP方法对OrfV阳性样品扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而绵羊痘病毒、蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、丝状支原体山羊亚种、山羊痘病毒及健康山羊皮肤的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对OrfV的最低检出量为5.3fg,比常规PCR方法高1 000倍。表明建立的LAMP方法特异性强,敏感性高。对6份临床样本的检测结果显示,OrfV阳性检出率为83.33%(5/6),与常规PCR的符合率为100%。本试验为羊口疮病例的临床诊断和OrfV的快速检测提供了新的方法。     

近期引起免疫失败的传染性腔上囊病病毒VP2基因的分子特征

用RT-PCR方法从2007年12月在安徽境内发生的两起传染性腔上囊病(IBD)免疫预防失败的病鸡腔上囊组织样品AH1与AH2中扩增出了传染性腔上囊病病毒(IBDV)VP2基因。序列分析表明,AH1与AH2病毒VP2基因长度均为1 350 nt,编码450 aa,七肽基序均为S-W-S-A-S-G-S,在222、253、256、279、284、294和299位上的氨基酸残基分别是A、QI、、D、AI、和S,具有IBDV强毒的分子特征,AH1和AH2感染的20日龄雏鸡产生明显IBD病变,死亡率为25%(1/4)。同源性分析表明,26个血清Ⅰ型IBDV毒株VP2基因核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为90.7%～99.6%和95.5%～100%,不同IBDV毒株VP2基因的七肽基序、特征性氨基酸残基以及高变区的亲水性有差异。在进化树上,26个血清Ⅰ型IBDV毒株可分为数组,其中的15个中国分离IBDV毒株不在同组,毒株之间的亲缘关系与分离地区或分离时间没有明显的联系。AH1和AH2与现行商品疫苗毒株B87的VP2基因核苷酸序列的差异率分别为5.3%和5.2%,这也进一步佐证了IBDV野毒VP2基因变异所引起的毒力变化和VP2抗原表位的漂移是导致当前IBD疫苗免疫预防失败的主要原因。     

23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析

用RT PCR及测序获得了 17株猪瘟病毒 (HCV) 2 5 1bp的E2基因主要抗原编码区序列 ,经DNAstar软件对获得的 17株HCV及已发表的 6株HCV毒株序列进行了比较和分析 ,并构建了HCV遗传发生树。结果 ,这 2 3株与石门株的序列相比 ,所有毒株的碱基变化随机地分布于整个序列 ,无缺失和插入 ,其中变化较大的区域位于序列的 3′端。 2 3株HCVE2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为 74.1%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 % ,其中 4株 2 0世纪 70～ 80年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 76.3 %～ 86.2 %、81.1%～ 87.8% ,10株 2 0世纪 90年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 75 .4%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 %。所绘制的遗传发生树分为 2个组群 (group) ,每个组群分为 2个亚组群 (subgroup) ,14株猪瘟 (HC)流行毒株在 2个组群中均有分布 ,2 0世纪 70～ 80年代分离的 3株 (75 % )在组 群 2 ,2 0世纪 90年代分离的 5株 (5 0 % )在组群 1     

甘肃犬瘟热病毒流行株N蛋白和H蛋白基因的序列分析

采用RT-PCR方法扩增了3株犬瘟热病毒(CDV)分离株的N、H蛋白基因,将其克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析。结果表明,获得的N蛋白基因序列与GenBank上登录的其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为92.5%～99.9%,获得的H蛋白基因与其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为81.7%～100%。由N蛋白基因和H蛋白基因推导的氨基酸序列构建的遗传进化树可知,这3株CDV流行株均处于野毒株的分支上,在N蛋白基因的遗传进化树上,CDV流行株呈现明显的地域性差异,而在H蛋白基因的遗传进化树上,不同国家和地区的CDV分离株之间虽有一定的地域联系,但与N蛋白基因相比,其地域性联系并不明显。说明这3株CDV流行株为野毒株,H蛋白基因的变异水平明显高于N蛋白基因,而N蛋白基因更能显示毒株与地域的关系。     

黑龙江省和河北省鸡新城疫病毒分离株的遗传变异分析

利用 RT PCR 技术扩增出了 4 株 NDV 分离株(HeB 4 99, HeB 5 99、HeB 6 02 和HLJ 10 02)F基因539 bp的片段,将该片段克隆到 pMD 18 T载体上。经酶切分析、质粒 PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得了4株 NDV分离株 F基因部分片段的重组质粒。同源性分析显示,4株分离毒株的核苷酸序列具有 95.9%~100%的同源性,与 LaSota的核苷酸序列同源性为81.0%~81.8%,与F48E9的核苷酸序列同源性达85.8%~89.3%。推导氨基酸序列分析表明,4个毒株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112RRQKRF117,具有强毒株裂解位点氨基酸组成特点,与ICPI和MDT测定结果相吻合。73株NDV毒株的系统发育进化树分析表明,HeB 4 99、HeB 5 99、HeB 6 02和HLJ 10 02均归属于基因Ⅶ型。     

广东鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的分子生物学特征

为了解广东地区鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的分子生物学特征,选择从该地区分离到的4株鸽源禽Ⅰ型副黏病毒(SD-55株、JM-11株、SZ-14株、ZQ-17株)进行了F基因的扩增及序列测定。结果表明,这4株病毒的F蛋白裂解位点均符合禽Ⅰ型副黏病毒强毒株裂解位点氨基酸序列的分子特征,与中国大陆鸽源APMV-1分离株Pigeon/YN-P1相比,相似率在95%以上。将其与GenBank中的18株鸽源禽Ⅰ型副黏病毒的相应序列进行比较分析,并绘制系统进化树,发现分离株SD-55株、JM-11株、SZ-14株位于以意大利分离株Pigeon/Italy/1166/00为代表的欧洲进化分支,而ZQ-17株位于以美国分离株Pigeon/U.S.(TX)/98为代表的美洲进化分支,经鉴定以上4株病毒均为基因Ⅵb1型禽Ⅰ型副黏病毒。     

新城疫病毒V4株L基因的克隆与序列分析

设计了 2对引物V4L1、V4L2和V4L3、V4L4 ,用RT PCR法对新城疫病毒 (NDV )V4克隆株的L基因进行了分段克隆。用V4L1、V4L2扩增出约 4 .1kb的V 4LA片段 ,用V4L3、V4L4扩增出约 3.5kb的V 4LB片段 ,分别对克隆出的 2个片段进行序列测定 ,并用DNAsis软件比较分析后进行拼接 ,得到长约 7.2kb、包含有NDVV4克隆株L基因全长的核苷酸序列。NDVV4克隆株L基因mRNA全长为 6 70 4bp ,拥有 1个 6 6 15bp的开放阅读框 ,推测其编码的氨基酸数为 22 0 4个。氨基酸同源性分析表明 :V4克隆株与HB92V4株L基因的同源性为 99.0 % ,与LaSota、B1、B1T(美国Takaaki分离株 )、BeaudetteC、Clone30、F4 8E9、SF0 2和ZJ1株的同源性为 94 .1%～96 .5 %。     

鹅副黏病毒QY分离株F基因和HN基因的克隆与序列分析

根据已发表的鹅副黏病毒基因组序列,设计并合成了扩增F基因和HN基因的5对引物,利用RT-PCR的特异性扩增出了广东省清远分离株(QY株)的F基因和HN基因。然后将其克隆入pMD 18-T载体,经鉴定、测序及拼接,QY株的F基因和HN基因全序列长度分别为1 662bp和1 716 bp,分别编码553个和571个氨基酸。经与GenBank登录的几株参考毒株F基因和HN基因编码区的核苷酸序列进行比较;结果,QY株与参考毒株SF02株和LaSota株F基因的核苷酸序列同源性分别为98.3%和82.4%,HN基因的核苷酸序列同源性分别为97.2%和75.9%。     

两株马立克病病毒的分离及相关致病基因序列的比较

为了解国内鸡群马立克病(MD)流行毒株的遗传特征,采用细胞培养、间接免疫荧光等方法从江苏省2个鸡场送检病鸡中分离鉴定出2株马立克病病毒(MDV)Ⅰ型毒株,采用PCR方法扩增两分离毒株的vIL-8、pp38、meq等病毒致病相关基因,所得序列用DNAStar软件与GenBank上登录的参考毒株进行比较分析.结果显示,两分离毒株的序列同源性为99.7%～100%,与MDV Ⅰ型强毒及超强毒株的同源性为99.3%～99.8%,具有强毒特征;两分离毒株的meq基因与其他4个国内分离强毒株的序列完全一致,在pp38基因编码的氨基酸序列中第109位均为甘氨酸而不是国外GA等毒株的谷氨酸,这与以前报道的另外3个中国野毒株一致.提示,这些变异可能是国内MDV流行强毒的遗传性特征.     

新城疫病毒广西分离株F基因的克隆和序列分析

根据GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)F基因序列设计了2 对引物,对从广西分离的10株NDV毒株的F基因进行了分段扩增和序列测定,其基因序列全长均为1 662 bp,编码553个氨基酸,均有6个潜在的糖基化位点。将其F基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表的10株NDV 参考株的F 基因序列进行了比较。结果表明,核苷酸序列的同源性为82.6% ~98.1%,氨基酸的同源性为87.7%~98.7%。这10株NDV广西分离株在裂解位点的氨基酸序列(112R R Q K/R R F117)与NDV强毒株特征相符合。系统发育树、酶切位点分析和基因分型结果表明,10 株NDV广西分离株中GX1/00、GX2/00、GX4/00、GX6/02、GX7/02、GX9/03、GX10/03和GX11/03为基因Ⅶd亚型,GX3/00和GX5/00为基因Ⅲ型。     

猪伪狂犬病病毒MQ18变异株的分离鉴定

为了解福建省猪伪狂犬病病毒(PRV)野毒株的病原学特性及分子遗传变异情况,本研究用羊胚胎鼻甲细胞(OFTu)从疑似暴发伪狂犬病猪场死亡的育肥猪中分离到1株病毒,该病毒能够产生典型的PRV细胞病变,病毒液接种小鼠(0.1 mL/只)及成年兔(0.5 mL/只)在48～60 h死亡,均表现出典型的伪狂犬病症状。经PCR试验、电镜观察及特异性血清间接免疫荧光试验鉴定为伪狂犬病病毒,命名为MQ18株;并对其进行病毒效价的测定及gC、gE基因核苷酸和氨基酸序列差异性分析。结果显示,分离株TCID50为10~(-7.71)/0.1 mL;将其gC和gE基因序列与国内外17个PRV参考毒株进行同源性比较,核苷酸序列同源性分别为93.5%～99.9%和97.8%～100%,氨基酸序列同源性分别为88.7%～99.8%和95.7%～100%;分子遗传进化树分析显示,gC和gE基因均与国内近6年分离的PRV变异株集聚在一起,属于同一个进化分支;与经典株相比,gC基因编码的氨基酸序列在第63～69位有1个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,gE基因编码的氨基酸序列分别在第48位和第496位有1个天冬氨酸(D)的插入,与PRV变异株变异位点相一致。以上结果证实,从发病猪群中分离到1株PRV变异株,本研究结果为选择合适疫苗来防控猪伪狂犬病以及病原学研究提供了参考。