牛冠状病毒牛肠病毒牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法的建立与应用

为建立一种可以快速检测牛冠状病毒（BCoV）、牛肠病毒（BEV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光PCR方法并应用于临床检测,根据BCoV N基因、BEV 5′-UTR基因、BVDV 5′-UTR基因设计3对特异性引物和探针,通过对引物、探针的浓度以及反应条件的优化,建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒三重一步法实时荧光PCR方法,并对该三重PCR方法的敏感性、重复性、特异性和临床样本检测结果进行了评价。结果显示,该方法灵敏度高,对BCoV、BEV和BVDV的最低检测限为10 copies/μL;重复性稳定,批内和批间变异系数（CV）均在2%以下;特异性强,对常见腹泻类病原无交叉反应。应用此方法检测河南省445份牛腹泻粪便样本,BCoV、BEV和BVDV的阳性率分别为6.5%(29/445)、17.5%(78/445)、12.1%(54/445)。上述结果表明,本研究建立了牛冠状病毒、牛肠病毒、牛病毒性腹泻病毒一步法三重实时荧光PCR方法,为疫病的快速检测及预防提供了有效的技术手段。     

牛结节性皮肤病病毒LAMP快检方法的建立与应用

本研究旨在建立一种特异性检测牛结节性皮肤病病毒（LSDV）的LAMP快检方法,以用于该病临床早期诊断与监测。笔者根据LSDV的特异性基因序列,设计了数十套LAMP引物,经过筛选最终确定1套反应效率最高的引物,其位于LSDV095基因序列内。以实验室保存的PUC57-LSDV质粒作为阳性质控进行方法的优化与验证,基于不同的检测需求,分别建立了实时浊度LAMP检测方法、实时荧光LAMP检测方法及荧光可视化LAMP检测方法。优化后的3种LSDV LAMP方法灵敏度均可达20 copies/反应的靶基因,与WOAH推荐的实时荧光PCR方法（5 copies/反应）相近;特异性良好,与山羊痘病毒（GTPV）、绵羊痘病毒（SPPV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、赤羽病病毒（AKV）、蓝舌病病毒（BTV）及口蹄疫病毒（FMDV）均无交叉反应。其中,实时浊度法操作程序简单,实时荧光法反应快速（25 min内完成检测）,荧光可视化法不依赖专用仪器及中心实验室。将所建方法应用于临床样本的检测,显示这3种方法均可特异性检测到LSDV,与实时荧光PCR方法检测结果一致性为100%,优于WOAH推荐的普通PCR...     

产志贺毒素Ⅱ型变异体大肠杆菌LAMP检测方法的建立

为建立产志贺毒素Ⅱ型变异体(Stx2e)大肠杆菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测方法,参照Gen-Bank中12条Stx2e序列和9条Stx2序列,针对Stx2e基因保守区域设计并合成4条引物,分别进行了反应条件优化、特异性试验、敏感性试验及模拟样品检测。结果显示,用所建立的LAMP方法对阳性样品扩增所得产物电泳后呈特征性梯状条带,阴性样品的扩增产物电泳后均无扩增条带。建立的LAMP方法对Stx2e+大肠杆菌的最低检出量为38CFU/管,敏感性高于PCR方法(3.8×103CFU/管)。LAMP和PCR对模拟样品检测结果的符合率为100%。该研究为仔猪水肿病的诊断和Stx2e+大肠杆菌的快速检测提供了新的方法。     

O157:H7型大肠杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的肠出血性大肠杆菌保守基因序列Stx1、Stx2设计合成荧光定量PCR引物和探针,对荧光定量PCR的反应条件进行优化,建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床分离病料进行了检测,并与常规PCR方法的检测结果做了对比.结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR方法的灵敏度达7.06×103CFU/mL,比常规PCR方法的灵敏度高106倍.用该方法和常规PCR对8种样品进行了检测,证实,该方法与常规PCR的阳性符合率为100%,具有较好的重复性.     

猪腺病毒3型SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对猪腺病毒3型(PADV3)的检测方法,根据PADV3E1B基因保守序列设计1对引物,建立了检测PADV3的SYBR GreenⅡ实时荧光定量PCR。结果显示,该方法不能对猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪博卡病毒、猪传染性胃肠炎、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、大肠杆菌、猪链球菌2型检测到荧光信号,特异性好;检测PADV3时在3.7×102~3.7×109 copies/μL范围内具有良好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单一特异峰,无引物二聚体,熔解温度为90.5℃;该方法组内变异系数为0.17%~1.23%,组间变异系数为0.73%~2.23%,重复性较好。应用该方法对临床56份腹泻粪便检测,检出11份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。上述结果表明,建立的实时荧光定量PCR为PADV3感染的早期诊断、流行病学调查奠定了技术基础。     

牛诺如病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

牛诺如病毒(BNoV)是国内新发的犊牛腹泻的病原,为建立高效快速、特异的BNoV定量检测方法,本研究参照GenBank登录的BNoV的RdRp基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物和1条探针,通过优化反应条件和体系,建立了BNoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,该方法选择的引物具有高度特异性,只对BNoV有特异性扩增,而对牛冠状病毒等4种犊牛腹泻常见病原未见扩增;对BNoV核酸最低检测限为15.9 copies/μL,且批内、批间变异系数均小于2%,重复性好。对采集自2017年9月至2019年11月河南、山东和四川省的261份犊牛腹泻样本进行检测,结果显示BNoV的阳性检出率为11.49%(30/261)。本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法对BNoV的病原检测和流行病学调查具有重要意义。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-LAMP检测方法的建立与应用

根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的保守序列各设计一套LAMP引物,在同一体系中进行RT-LAMP扩增,通过对体系内引物浓度及反应温度等进行优化,建立了可在63℃恒温下对CSFV和PRRSV进行同步检测的LAMP方法,并进行了敏感性和特异性试验。结果显示,该方法的灵敏度与荧光定量RT-PCR相当,与常规RT-PCR相比高10倍;用该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型进行RT-LAMP扩增,均未发生交叉反应。用该法对采自天津市4个猪场的52份临床样品进行检测,与荧光定量RT-PCR检测结果的符合率为100%。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,可实现两病原的同步快速检测,是临床疫病初筛技术的强有力候选。     

牦犊牛流行性腹泻病原的调查

流行性腹泻是山丹马场牦犊牛发病最多、危害最重的疾病之一。应用酶联免疫吸附试验和常规细菌检验方法,对采自本场区的106份腹泻粪便进行检查,检出致病病原物95份,阳性率90％(95/106)。95份阳性病原物中单独大肠杆菌、单独轮状病毒、大肠杆菌和轮状病毒混合感染率分别为44％(42/95)、19％(18/95)、37％(35/95)。用聚丙烯酰胺凝胶电泳对轮状病毒进行核酸电泳分析,查出不同于牛NCDV标准株的三种类型的电泳型。电镜观察呈典型轮状病毒结构。调查初步揭示:山丹场区牦犊牛流行性腹泻是由大肠杆菌、轮状病毒单独或混合感染所引起。     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

旋毛虫LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种快速、准确的动物肉品中旋毛虫检测方法,根据旋毛虫ITS-Ⅱ基因序列,设计环介导等温扩增技术(loop-m ediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行LAMP扩增。将旋毛虫DNA进行梯度稀释,以其为模板分别进行LAMP和常规PCR扩增,分析LAMP检测技术的敏感性。分别以旋毛虫、弓形虫、捻转血矛线虫、柔嫩艾美耳球虫、猪囊尾蚴、大肠杆菌等病原的基因组DNA为模板,进行LAMP检测,分析该检测方法的特异性。用该LAMP检测方法,分别对模拟样品和市售猪舌、鸭舌、鸡舌、羊舌和牛舌等110份样品进行旋毛虫感染情况检测。LAMP扩增产物的电泳结果和可视化SYBR G reen I荧光染料颜色的变化均表明该LAMP检测方法建立成功。当模板DNA稀释到10~(12)时亦可以检测,其敏感性是常规PCR的1 000倍。特异性研究发现,只有以旋毛虫基因组DNA为模板所进行的LAMP检测才出现阶梯形的电泳条带并且其SYBR Green I荧光染料呈现绿色荧光。在2 g肌肉中添加1条旋毛虫肌幼虫时亦能被该LAMP方法检测出来。但110份舌肌样品中均未检测到旋毛虫,LAMP检测结果与常规PCR结果一致。结果表明,本研究建立了基于旋毛虫ITS-Ⅱ基因的LAMP检测技术,该技术具有较好的敏感性和特异性,在样品检测中具有简便快捷的优点。     

牛轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速特异的定量检测牛轮状病毒的荧光定量PCR方法,本研究从牛轮状病毒NCDV株DNA中扩增的VP6基因片段(211 bp)并克隆于pMD19-T载体(p MD19-T-VP6)作为重组质粒标准品,建立了SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果表明,VP6片段长211 bp,经鉴定所构建的重组质粒成功;用该质粒测得real-time PCR的最低检测量为15.39 copies/L。用该方法检测猪传染性胃肠炎病毒、牛细小病毒、猪流行性腹泻病毒及伪狂犬病病毒的结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。重复性试验结果表明,批内和批间重复变异系数均小于3%,表明该方法具有良好的重复性。以上结果表明,本研究建立的基于VP6基因的牛轮状病毒qRT-PCR检测方法具有特异、灵敏、快速等特点,可用于牛轮状病毒的早期诊断。     

副猪嗜血杆菌与猪链球菌2型双重LAMP检测方法的建立

根据副猪嗜血杆菌的inf B基因和猪链球菌2型的Cps2j基因各设计1套LAMP引物,在同一体系中进行双重LAMP扩增,采用琼脂糖凝胶电泳和SYBR GreenⅠ荧光检测,并对双重LAMP扩增产物进行熔解曲线的分析,建立了副猪嗜血杆菌与猪链球菌2型双重LAMP检测方法并进行了特异性和灵敏度试验。结果显示,该方法的灵敏度比常规PCR高两个数量级。通过熔解曲线特征峰的分析可以判断感染的确切目标菌株,且与其他的病原菌无交叉反应。对29份临床样品检测的结果显示,普通PCR和双重LAMP的检出率分别为17.0%和31.0%。结果表明,该方法具有良好的灵敏度和特异性,可实现两种病原的同步快速检测,对于临床疫病的初筛有一定的帮助。     

对虾白斑综合征病毒LAMP检测方法的建立

根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28的基因序列设计合成4条特异性引物,以pMDT-VP28重组质粒为标准模板,通过优化反应体系和反应条件,建立了WSSV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定LAMP对WSSV-DNA的最低检测限,并与巢式PCR进行了比较。结果显示,该LAMP方法的最佳反应温度为65℃,反应时间为60min;LAMP对WSSV的最低检测限为10copies/μL,而巢式PCR为100copies/μL,表明该LAMP方法的敏感性显著高于巢式PCR检测方法。因此,WSSV的LAMP检测方法比PCR更为简便、快速、灵敏,且无需昂贵的变温仪器,更适应水产养殖的现地检测,本研究为WSSV早期感染的快速检测提供了新方法。     

产肠毒素型大肠杆菌腹泻小鼠模型中小肠AQP3和AQP4的表达

为探讨产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)小鼠腹泻模型中小肠水通道蛋白表达量的变化,运用Real time PCR和ELISA分别检测了ETEC腹泻小鼠模型中空肠AQP3和回肠AQP4的基因表达量和蛋白质质量浓度。结果显示,小鼠在感染ETEC产生腹泻后,空肠AQP3和回肠AQP4的基因表达量和蛋白质质量浓度均呈时间依赖性下降。结果提示,ETEC引起腹泻的机制可能与其改变了小肠水通道蛋白的表达有关。     

牛轮状病毒VP6蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立检测牛轮状病毒(BRV)的双抗体夹心ELISA方法,本研究制备了家兔抗牛轮状病毒VP6蛋白的多克隆抗体,并以VP6蛋白为免疫原通过细胞融合和筛选获得了5株分泌抗BRV VP6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别被命名为5C9、3G10、6E11、4D10和5A3。Western-blot和间接免疫荧光试验结果均表明,5株单抗与BRV具有良好的亲和性。以纯化的家兔抗BRV VP6蛋白多抗为捕获抗体,以4D10单抗为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。敏感性试验表明,该方法对BRV的最低检出量(TCID50)为9.884×104/m L。特异性试验结果表明,与PRV、PEDV、BPV及TGEV均无交叉反应。板间和板内重复性试验结果显示,该方法具有良好的重复性。对95份临床样品进行检测,与RT-PCR方法比较,符合率为100%。综上,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于BRV的快速检测。     

牛星状病毒及牛环曲病毒双重RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立能同时快速检测牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)和牛环曲病毒(bovine torovirus,BToV)的方法,本研究根据BAstV的ORF1a和BToV的S基因的保守区域分别设计了2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了能够同时检测BAstV和BToV的双重RT-PCR方法。特异性结果显示,该方法与牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRo V)、牛诺如病毒(bovine norovirus,BNoV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)和牛嵴病毒(bovine kobuvirus,BKoV)无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对BAstV和BToV质粒标准品的最低检出下限分别为1.12×10~4copies/μL和1.0×10~3copies/μL。应用该方法和各病原RT-PCR方法同时对221份河南省犊牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BAstV的阳性率为18.1%,BToV的阳性率为19%,其中BAstV和BToV共感染的阳性率为6.79%,双重RT-PCR方法和各病原RT-PCR方法的符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重RT-PCR方法可用于BAstV和BToV的病原监测及流行病学调查。     

禽源致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立定量检测禽致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR GreenⅠqPCR方法,设计特异性引物,用PCR扩增irp2基因片段,克隆至载体p MD18-T,转化DH5α细胞,提取阳性重组质粒。以重组质粒为标准模板,建立定量检测irp2基因的特异性荧光定量PCR方法,进行特异性、灵敏度、重复性等性能评价,并对临床分离的187份疑似禽致病性大肠杆菌进行irp2基因定量检测。结果显示,PCR扩增片段的大小为261 bp,与Gen Bank中已知基因序列的同源性为100%,建立的qPCR方法 Ct值与标准品模板在4.1×100~2.3×1010copies/L范围内呈良好的线性关系,扩增曲线呈"S"形,相关系数为0.978,斜率为-3.286。该方法与副鸡嗜血杆菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)无交叉反应,灵敏度达到2.3×100copies/L,比常规PCR高1 000倍,重复性变异系数小于4.00%。使用建立的irp2 qPCR对采集的疑似禽致病性大肠杆菌病料进行荧光定量PCR检测,阳性检出率为36.4%,显著高于普通PCR检测率。结果表明,建立了禽源大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,该方法适用于含HPI+毒力岛致病性大肠杆菌的快速筛选、毒力基因及其转录水平的定量检测,可为禽大肠杆菌病防控提供技术支持。     

同时检测PEDV和TGEV及PDCoV的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为建立一种同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCo V)的多重RT-PCR方法,根据Gen Bank中PEDV和TGEV基因序列保守区设计2对引物,参照文献合成1对PDCo V引物,优化三对引物在同一RT-PCR扩增体系下的浓度、退火温度等反应条件,同时优化方法的灵敏度、特异性。将初步建立的多重RT-PCR方法用于检测采自四川省及重庆市14个猪场的222份样品。结果表明,本试验建立的多重RT-PCR在引物量分别为PEDV 0.2 L,PDCo V 0.2 L和TGEV 0.4L,退火温度为53℃时的扩增效果最佳;最低检测量分别为PEDV:60.96 pg、PDCo V:58.85 pg、TGEV:102.69 pg;用该法对多种猪传染病病原DNA或c DNA进行扩增时均无非特异性扩增条带出现。对222份腹泻样品的检测结果表明,PEDV阳性检出率为52.2%,PDCo V为2.7%,TGEV为2.3%。同时多重RT-PCR检测方法和单项RT-PCR检测方法符合率分别为PEDV 92.9%、PDCo V 100%、TGEV 100%。表明该法具较高可信度。本试验建立了一种高效、特异地同时检测PEDV、TGEV和PDCo V的多重RT-PCR方法,为病原的实验室诊断和分子流行病学调查提供了技术支持。对四川省及重庆市部分猪场三种病原流行情况进行调查和统计分析,为地区猪腹泻病的防控提供了依据。     

猪鼻支原体LAMP快速诊断检测方法的建立

采用环介导等温扩增(LAMP)技术,以猪鼻支原体的P37基因序列为靶基因,设计1组特异性引物,对反应体系的引物浓度、MgSO_4、dNTPs、反应温度和时间进行优化,并进行了特异性和灵敏度试验,旨在建立猪鼻支原体(Mhr)的简便、快速、准确的分子检测方法。同时应用所建立的方法对临床样品进行检测,结果显示,最佳反应体系为MgSO_46 mmol/L,dNTPs 1.2 mmol/L,内引物(FIP/BIP)1.6 μmol/L,外引物(F3/B3)0.2 μmol/L,Bst DNA聚合酶8 U,60℃扩增60 min。灵敏度是常规PCR的100倍并且与其他病原菌无任何交叉反应。对23份呼吸道疾病临床样品进行检测的结果显示,普通PCR和LAMP的检出率分别为23.4%和79.6%。表明建立的LAMP检测方法可以用于Mhr的常规检疫。     

牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种能够快速、简便地检测牛、羊赤羽病病毒的分子生物学方法,根据赤羽病病毒特异性S基因的6个特异区域设计了2对引物,首次建立了赤羽病病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法,对LAMP反应条件进行了优化,并将其与普通PCR方法进行比较。结果显示,LAMP检测方法的特异性好,只对赤羽病病毒进行扩增,且操作简便。本研究确定的最佳反应温度为63℃,核酸检测的最低检出限为1.08ng/μL,比普通PCR的灵敏度高2个数量级。该方法为赤羽病病毒的一种最新的快速、简便的检测方法,可用于出入境牛、羊赤羽病的快速检测。