H5N1亚型禽流感病毒HA基因在sf9细胞中的表达

本研究选用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统构建含有H5N1亚型禽流感病毒HA主要抗原基因的重组杆状病毒,并感染sf9昆虫细胞表达HA抗原蛋白。首先,分析禽流感病毒H5N1亚型HA基因编码的氨基酸序列,选取抗原表位集中特异性保守的HA序列,构建重组供体质粒p Fast HA,转化DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR检测,获得重组穿梭载体Bacmind HA。脂质体法转化对数生长期的sf 9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac HA。经Western-blotting检测及间接免疫荧光(IFA)分析,结果表明,HA蛋白在sf9昆虫细胞中正确表达,分子质量约为45 ku,并具有良好的反应原性。为进一步研制H5N1亚单位疫苗的研发及研制H5亚型ELISA抗体试剂盒奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒Erns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Erns基因的生物学功能,将含有牛病毒性腹泻病毒 Erns基因的质粒pMD18-T-Erns经BamH I／HindⅢ双酶切,获得了Erns片段,再与杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A连接,构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBacHis2A-Erns与Bac-N-BlueTM DNA 共转染至sf9昆虫细胞中,获得了重组病毒,经噬斑筛选纯化,感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS- PAGE分析结果表明,表达的目的蛋白大小约30 ku;Western-blotting检测表明,该蛋白具有良好的抗原性。     

H3亚型猪流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达及其间接ELISA检测方法的建立

根据GenBank上登录的H3亚型猪流感病毒HA基因序列设计了1对引物,经PCR扩增出HA基因目的片段,并将其克隆到pFastBacGP67C杆状病毒载体上,筛选阳性重组转座载体pFastBacGP67C-H3,转化至含有杆状病毒穿梭载体(bacmid)的DH10Bac感受态细胞,构建杆状病毒表达载体,获得重组转座子rBacmid-H3,在脂质体介导下转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBv-H3,将其感染sf9昆虫细胞,收获目的蛋白。经血凝试验、SDS-PAGE、Western-blot、免疫组织化学分析,结果表明,HA蛋白得到表达,且具有良好的免疫学活性。用表达的HA蛋白作为包被抗原,初步建立了H3亚型猪流感病毒的间接ELISA检测方法,通过对93份送检的疑似猪流感血清进行检测,结果显示,检出阳性率为46.24%。上述结果为建立快速、准确、简便的H3亚型猪流感鉴别诊断试剂盒奠定了基础。     

牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pFB-gE转化到杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,制备重组杆粒rBacmid-gE。将该重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9,获得与gE基因发生重组的杆状病毒。Western-blot分析及间接免疫荧光试验(IFA)的结果显示,重组杆状病毒在Sf9中表达了分子质量大小约为43ku的gE融合蛋白,该融合蛋白分别与小鼠抗His标签单克隆抗体和小鼠抗BHV 1多克隆抗体发生特异性结合,表明获得的gE融合蛋白具有良好的免疫反应性。本研究为进一步获得高特异性的诊断抗原奠定了基础。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术,扩增出口蹄疫病毒(FMDV)VP2基因,并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞,获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后,感染sf9细胞,表达VP2融合蛋白,分子质量为33 ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体,通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定,说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达,且可以与牛抗O型FMDV血清发生特异性反应。     

番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在sf-9昆虫细胞中的表达

采用RT-PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因,将其克隆到pFastBacHTA载体上,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC;将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑和PCR筛选,获得重组转座子rBacmid-σC。在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBV-σC;SDS-PAGE和Western-blot分析表明,在sf-9细胞中表达了分子质量约37 ku的σC蛋白,该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应,这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NP基因在昆虫细胞中的表达及其表达产物的生物学活性

根据GenBank上登录的H5N1亚型高致病性禽流感病毒(HPAIV)核蛋白(NP)基因序列设计引物,通过PCR扩增出A/Goose/HLJ/QFY/04(H5N1)毒株的NP基因片段,将其克隆到pFastBacGP67B杆状病毒载体上,将筛选的阳性重组转座载体pFastBacGP67B-NP转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,构建了杆状病毒表达载体,获得了重组转座子(rBacmid-NP),在脂质体介导下转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBv-NP).SDS-PAGE分析、Westernblotting检测、免疫组化分析和ELISA试验结果表明,分子质量约为54 ku的重组核蛋白得到了高效表达,该表达蛋白具有良好的生物学活性.     

禽呼肠孤病毒99G株σB编码基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

采用RT-PCR方法扩增禽呼肠孤病毒(ARV)99G株σB编码基因,序列分析表明,99G株σB编码基因与其他禽呼肠孤病毒的同源性为90%～99 9%,而与我国番鸭呼肠孤病毒S12株的同源性仅有60%;用BarnH Ⅰ和Xho Ⅰ酶将σB编码基因切下并克隆到表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-σB;鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,σB基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白的41.46%,融合蛋白的分子质量为66 ku,主要以包涵体形式存在;Western-blot结果显示,该融合蛋白能与抗ARV阳性血清发生特异性反应,表明重组蛋白具有良好的反应原性,可用于禽呼肠孤病毒病诊断试剂盒和基因工程疫苗的研制.     

禽呼肠孤病毒σC蛋白的真核表达及亚细胞定位的初步分析

本研究根据GenBenk中σC的序列设计特异性引物,通过PCR扩增σC基因,构建真核表达载体pEF1α-HA-σC,转染DF1细胞,在DF1细胞中表达ARVσC蛋白。结果显示,成功在DF1细胞中表达ARVσC蛋白,大小约为37 ku,Western-blot分析表明,表达的蛋白具有良好的反应原性,激光共聚焦显微镜观察发现在DF1细胞中表达的σC蛋白定位于细胞质中。本研究为今后深入研究σC蛋白在ARV感染过程中的功能和在ARV天然免疫中的具体调控机制奠定了基础。     

A群猪轮状病毒G5型OSU株VP7基因的克隆及其重组杆状病毒的鉴定

利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出A群猪轮状病毒(PRV)G5型OSU株长度约为1.0kb的基因片段,将其克隆到pMD 18-T载体上进行测序鉴定,证明为该PRV的VP7蛋白基因,与已发表的该PRV VP7基因序列的同源性为99.8%.将该基因黏端克隆至表达载体PblueBAChisC质粒中,酶切及PCR鉴定表明获得了PRV-VP7蛋白基因与PblueBAChisC质粒的阳性重组子.纯化该重组质粒并与线性杆状病毒DNA分子Bac-N-Blue共转染昆虫细胞sf9,5 d后收获重组病毒.通过对重组杆状病毒DNA分子的酶切及PCR鉴定,确定PRV-VP7基因已正确插入.将经3次蚀斑筛选纯化后的该重组杆状病毒接种于sf9细胞大量增殖后,获得了重组杆状病毒PRV-VP7蛋白的真核表达.     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

表达猪圆环病毒2型SH1分离株Cap蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

通过PCR方法扩增完整的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因,随后将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统pFastBacTMHTB载体中,将筛选获得的阳性重组质粒pF-Cap转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBac-Cap。在脂质体介导下转染处于对数生长期的Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc-Cap。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,成功构建了表达PCV2Cap蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白具有良好的反应原性,这为进一步研究Cap蛋白的功能及免疫学特性奠定了基础。     

禽网状内皮组织增生病病毒gp90基因在杆状病毒中的表达及其产物的活性分析

以质粒pMD18T-env为模板,利用PCR技术扩增禽网状内皮组织增生病病毒的gp90基因,酶切、纯化后,克隆至载体pFastBacHTA中,构建了重组供体载体pFgp90,并将其转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,使gp90基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体Bacmidgp90.通过脂质体介导将其转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp90.抗gp90蛋白小鼠超免疫血清介导的Western-blot分析和间接免疫荧光试验(IFA)结果显示,gp90蛋白被正确表达,分子质量约为45 ku;gp90蛋白在变性和自然状态下均能够被识别,具有良好的生物活性.     

牛轮状病毒VP7基因在昆虫细胞中的表达

利用PCR方法扩增出牛轮状病毒外衣壳蛋白VP7基因,经BamHⅠ+PstⅠ特异性酶切后,连接于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA中,成功构建了重组质粒pFastBacHTA-VP7。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素筛选和PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-VP7。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白,对表达的蛋白进行SDS-PAGE分析和Western-blot分析。结果显示,成功扩增了VP7基因,大小为981bp,所表达的重组蛋白大小为40.4ku,与预期值相符,该蛋白能与牛轮状病毒阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性。此研究结果为进一步研发牛轮状病毒ELISA检测试剂盒奠定了物质基础。     

H3N8亚型马流感病毒M1基因在昆虫细胞中的表达及活性分析

为建立H3N8亚型马流感血清学诊断方法,将H3N8亚型马流感病毒A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)M1基因插入到杆状病毒转移载体pFastBac Dual中,构建重组转移质粒pFastBac Dual-M1;将pFastBac Dual-M1转化到DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选重组穿梭质粒rBD-M1;在脂质体转染试剂介导下将rBD-M1转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,拯救重组杆状病毒rBV-M1;rBV-M1感染Sf9细胞后,通过Western-blotting和免疫组织化学染色进行蛋白表达分析。结果表明,获得了分子质量为27ku的特异性M1蛋白,而且该蛋白具有良好的免疫活性。M1蛋白的成功表达为以M1蛋白作为诊断抗原的研究奠定了基础。     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T-HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒(AIV)HA1基因,并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1,与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经3次蚀斑纯化,得到重组杆状病毒rpBlueHisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示,HA1在昆虫细胞中得到表达,且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明,重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明,重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

H3N8亚型马流感病毒VLPs的构建及其生物学特性分析

为了构建含H3N8亚型马流感病毒HA蛋白和M1蛋白的病毒样颗粒疫苗,把A/equine/Xinjiang/3/2007(H3N8)的HA基因和M1基因克隆到杆状病毒穿梭载体pFastBac Dual中,将得到的重组穿梭质粒pFBD-XJ3HA-M1转化至DH10Bac感受态细胞,与杆状病毒骨架质粒Bacmid进行重组从而获得重组杆状病毒转座子rBac-XJ3HA-M1,然后将其转染Sf9昆虫细胞,包装重组杆状病毒rBV-XJ3HA-M1。通过PCR鉴定、细胞免疫组织化学试验、Western-blot分析以及血凝试验证明,HA蛋白和M1蛋白在昆虫细胞中能够有效表达,且表达产物具有良好的反应活性,表达的HA蛋白具有血凝活性。电镜观察发现,HA蛋白和M1蛋白能够稳定形成病毒样颗粒。上述研究结果为研制马流感亚单位疫苗提供了技术储备,也为马流感病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

寨卡病毒NS1蛋白在杆状病毒系统中的表达及免疫原性分析

本研究旨在采用杆状病毒表达系统表达并纯化寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)NS1蛋白,并对其免疫原性进行鉴定。将ZIKV NS1基因克隆至杆状病毒载体pFastBac1中,构建重组转移载体,将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染sf9细胞,获得重组杆状病毒,经SDSPAGE和Western-blot鉴定蛋白正确表达后,将其感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,将纯化后的ZIKV NS1蛋白免疫BALB/c小鼠,进行血清特异性抗体效价检测。最终结果显示,获得了纯度较高分泌表达的ZIKV NS1蛋白,并且血清特异性抗体效价实验表明,纯化的ZIKV NS1蛋白能够诱导小鼠产生特异性免疫反应,有很好的免疫原性。本研究为ZIKV疫苗和诊断试剂盒的研发奠定了重要的基础。     

非洲猪瘟病毒PP62蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定

为表达非洲猪瘟病毒PP62蛋白,将非洲猪瘟病毒pp62基因克隆至pFastBac-HTA载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒rBac-pp62。将该重组病毒感染Sf9细胞后,采用间接免疫荧光(IFA)检测PP62蛋白的表达,通过亲和层析纯化重组蛋白PP62,以Western-blot和间接ELISA方法鉴定纯化的重组蛋白PP62的免疫反应活性。结果显示,重组杆状病毒rBac-pp62感染的Sf9细胞可以大量表达PP62蛋白,纯化的PP62重组蛋白能够与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应,以重组蛋白PP62为包被抗原建立的间接ELISA方法可以区分非洲猪瘟阳性血清和阴性血清。结果表明,表达的重组蛋白PP62具有良好的反应活性,可作为开发非洲猪瘟抗体检测试剂盒的抗原以及用于PP62蛋白的结构和生物学功能研究。     

恒河猴干扰素-γ基因的原核表达及其免疫活性的初步研究

为构建以恒河猴干扰素-γ为目的基因的原核表达重组质粒并进行免疫活性分析,获得具有生物学活性重组IFN-γ蛋白。应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从恒河猴外周血单个核细胞(PBM C)扩增干扰素-γ基因,然后将其克隆至表达载体p ET32a(+)中,转化BL21(D E3)进行诱导表达。SDS-PAG E电泳分析其可溶性,W estern-blot检测纯化后的重组蛋白,采用淋巴细胞增殖试验检测重组IFN-γ的活性。结果显示,成功构建恒河猴干扰素-γ原核表达重组菌,重组蛋白分子质量约为35.4 ku,主要以包涵体形式存在。重组IFN-γ具有促进淋巴细胞转化增殖的生物学活性。结果表明,本试验成功获得了重组IFN-γ蛋白,表达量高且具有生物学活性,为重组IFN-γ治疗恒河猴疾病奠定了基础。