野鸭源新城疫病毒V蛋白抑制宿主细胞干扰素β产生的机制研究

为研究野鸭源新城疫病毒(ND V)V蛋白抑制宿主细胞干扰素β(IFN-β)产生的机制,构建真核表达新城疫病毒强、弱毒株V蛋白的重组载体,分别与IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRDⅢ/Ⅰ-Luc、AP-1-Luc报告质粒共转染H EK-293T细胞,接种仙台病毒刺激宿主细胞后,测定宿主细胞的相对荧光素酶活性。结果显示,新城疫病毒强毒株V蛋白(vNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1、PRDⅢ/Ⅰ启动子活性,新城疫病毒弱毒株V蛋白(aNDV-V)能抑制NF-κB、AP-1启动子活性,进而抑制IFN-β的产生。构建新城疫强弱病毒V蛋白嵌合体进行试验,结果表明NDV强毒株V蛋白羧基端在抑制PRDⅢ/Ⅰ启动子活性中发挥关键作用。研究结果为深入研究V蛋白对抗宿主细胞天然免疫机制奠定了基础。     

旋毛虫Ts43基因真核表达载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

利用RT-PCR技术从黑龙江省猪源旋毛虫获得了Ts43基因,并克隆入pcDNA3.1-CT-GFP真核表达载体中构建重组质粒,用该重组质粒在脂质体介导下转染Vero E6细胞,GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液样品中有1条约66 ku的条带,可被小鼠旋毛虫阳性血清所识别,与预计大小一致,说明,真核表达载体pcDNA3.1-CT-GFP中的Ts43基因在VeroE6细胞中获得了表达,表达产物具有抗原性。     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白3基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

采用PCR技术从刚地弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因,并克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.将重组质粒转染BHK-21细胞.间接免疫荧光染色证明,质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达.Western-blot分析证实,细胞裂解液及上清样品中有1条约39.2 ku的条带,可被山羊抗刚地弓形虫超免疫血清所识别,大小与预测值相符.表明,真核表达质粒pcDNA3-MIC3中的MIC3基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性.     

新城疫病毒调控宿主YB-1蛋白的初步研究

为了揭示YB-1蛋白在新城疫病毒(NDV)感染中的作用,对NDV感染细胞中YB-1表达水平以及亚细胞定位的变化进行了初步探索。利用RT-PCR技术,从鸡胚成纤维细胞中扩增了鸡源YB-1蛋白基因,序列分析结果显示其与其他物种YB-1有较高的相似性,与人YB-1的核苷酸和氨基酸相似性分别为88.3%和78.9%。随后利用间接免疫荧光技术检测了感染NDV强毒株Herts/33的He La和DF-1细胞中内源性YB-1蛋白的亚细胞定位变化,用q RT-PCR方法检测了YB-1 m RNA表达水平,通过Western-blot检测了YB-1蛋白水平的时相变化。结果显示,He La细胞中YB-1主要存在于细胞质,而禽源DF-1细胞YB-1集中在细胞核内;感染NDV后,两种细胞中的YB-1蛋白均在细胞质内呈现颗粒化聚集,同时在NDV感染后期He La细胞中YB-1蛋白出现少量降解。该研究初步揭示了NDV感染过程中YB-1蛋白的迁移现象,推测与NDV的复制过程相关,其具体的作用机制以及对NDV复制的影响尚待更深入的研究。     

绵羊痘病毒E3L基因在Vero细胞中的表达

为了构建组成型表达绵羊痘病毒E3蛋白的真核表达载体,并检测E3蛋白在Vero细胞中瞬时表达的情况,将绵羊痘病毒E3L基因亚克隆至pcDNA3.1(+)表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-E3L,经酶切和测序鉴定正确后转染至Vero细胞,利用Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)对E3蛋白的表达水平进行鉴定。结果显示,转染后第48小时可检测到E3L基因高水平的表达。这一研究结果为进一步研究绵羊痘病毒E3蛋白的生物学功能奠定了基础。     

鸭瘟病毒UL51基因在COS-7细胞中的瞬时表达

为阐明鸭瘟病毒(DPV)UL51基因的特性和功能,根据DPV UL51基因序列设计了1对特异性引物,用PCR方法扩增UL51基因,并将其克隆至pMD18-T栽体上,经双酶切和测序鉴定后,再将该目的片段亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上,得到重组质粒pcDNA3.1-UL51,通过脂质体介导将其转入COS-7细胞;应用实时荧光RT-PCR、Western-blotting和间接免疫荧光法检测UL51基因在COS-7细胞中的转录、表达和定位情况.结果表明,UL51基因在转染后6 h即已开始转录,12 h开始表达,24 h时转录和表达量均达最高峰,之后逐渐降低.该基因在COS-7细胞中表达蛋白的分子质量为33 ku.比预测的分子质量(约27.1 ku)大.间接免疫荧光法显示,该基因产物早期聚集于COS-7细胞的近核区域,晚期位于胞浆和胞核中.     

传染性脓疱病毒112基因的原核表达及亚细胞定位

对本实验室分离的传染性脓疱病毒(ORFV)AH-F10株的112基因进行克隆、原核表达及亚细胞定位。通过PCR方法获得其112基因,并分别构建原核表达重组质粒pET-32a-112及真核表达重组质粒pEGFP-C3-112。pET-32a-112经IPTG诱导表达,获得112蛋白并制备超免疫血清。同时将pEGFP-C3-112转染BHK21细胞,观察病毒112蛋白的亚细胞定位。结果显示,pET-32a-112在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;Western-blot结果表明,重组112蛋白具有良好的反应原性;112蛋白主要定位于细胞质中。本试验为进一步研究112蛋白的功能奠定了一定的理论基础。     

猪2型圆环病毒核酸疫苗的研制及其对小白鼠的免疫效果

为研制猪2型圆环病毒(PCV2)新型核酸疫苗,以pcDNA3为载体,与PCV2的ORF2及其高变区V1、V2、V3、V1-V2连接,分别成功构建了真核表达质粒pcDNA3-ORF2、pcDNA3-V1、pcDNA3-V2、pcDNA3-V3和pcDNA3-V1-V2。对阳性真核表达质粒大量生产并纯化后,以每只小白鼠0.2 mg免疫5周龄左右的雌性小白鼠,然后用ELISA检测免疫小白鼠血清中抗体的产生情况。结果显示,这5种真核表达质粒均能刺激小白鼠产生特异性抗体,但相比之下,真核表达质粒pcDNA3-V1-V2诱导小白鼠产生的抗体水平更高,维持的时间更久。表明质粒pcDNA3-V1-V2的免疫效果较好,有望成为防制猪2型圆环病毒的候选疫苗。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位区与猪细小病毒VP2真核表达质粒的构建及免疫效果

筛选了3个位于流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白上不同位置的抗原表位区基因,利用重叠PCR方法分别与猪细小病毒(PPV)VP2基因相连。将目的基因定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建了重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2。将重组质粒在无免疫佐剂参与的情况下免疫BALB/c小鼠,同时设空质粒接种组及PBS缓冲液接种组作为空白对照,采用ELISA法、淋巴细胞增殖试验和流式细胞仪技术分别对抗体水平、脾淋巴细胞转化功能和小鼠外周血中CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞数进行检测。结果显示,重组质粒pcDNA3.1-EA-VP2、pcDNA3.1-EB-VP2、pcDNA3.1-EC-VP2接种小鼠后,都能诱导小鼠产生JEV、PPV特异性抗体,并且促进脾淋巴细胞增殖。试验组与对照组比较差异极显著(P0.01);试验组小鼠CD3+、CD4+T淋巴细胞数在首疫后第7天高于对照组(P0.01),CD8+T淋巴细胞数在首免后第14天高于对照组(P0.01)。pcDNA3.1-EB-VP2免疫组小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平均高于pcDNA3.1-EA-VP2和pcDNA3.1-EC-VP2免疫组。表明,用JEV E蛋白抗原表位区基因与PPV VP2基因构建的真核表达质粒能够诱导小鼠产生良好的细胞免疫和体液免疫应答。     

鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL18克隆质粒扩增获得了ChIL18全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序,鸡IL18全基因被正确重组到pcDNA3.1( )真核表达质粒上;将重组真核表达质粒pcDNA3.1( )ChIL18转染COS7细胞,转染细胞中含ChIL18基因的mRNA。SDSPAGE分析表明,表达产物是与ChIL18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

DNA疫苗体外与体内表达及鉴定方法的建立

为了确定作为疫苗的质粒DNA能否在真核细胞中表达和探讨其是否有可能和宿主DNA发生整合,基于弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-GRA6建立了鉴定DNA疫苗在真核细胞内表达以及其是否与宿主DNA重组的方法。以黄色荧光蛋白为标记优化DNA疫苗体外转染真核细胞的最佳条件,然后通过RT-PCR和Western-blot方法对目的蛋白GRA6的表达进行了鉴定。DNA疫苗免疫小鼠后,在不同时间点用PCR方法检测质粒DNA在体内组织样本中的分布,探讨了质粒DNA是否能与宿主DNA发生整合。结果显示,弓形虫DNA疫苗pcDNA3.1-GRA6在质粒DNA与转染试剂的比例为1∶8时体外转染效果最好,RT-PCR和Western-blot方法均证明其可以在真核细胞中表达。免疫后第28天,pcDNA3.1-GRA6免疫组小鼠的脾、肝等组织的基因组DNA样品均可扩增出GRA6基因片段;而免疫后第56天,各组织均未扩增出特异性GRA6基因片段。表明质粒DNA只能短暂存在于体内。因此,DNA疫苗重组质粒体外与体内鉴定方法的建立,为DNA疫苗开发提供了一个较为系统的研究基础。     

A型禽流感病毒NS1蛋白的表达及其诱导细胞凋亡功能的研究

利用瞬时表达方法表达禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,并初步研究了体外表达的NS1蛋白对宿主细胞凋亡的影响.应用脂质体介导法,将含有不同亚型AIV NS1基因的阳性质粒pcDNA3.1(+)-qNS1(H5N1)、pcDNA3.1(+)-rNS1(H9N2)转染Vero细胞系及MDCK细胞系.经SDS-PAGE及Western-blotting检测,qNS1和rNS1基因在Vero细胞及MDCK细胞中均获得了表达.应用AO/EB荧光染色法、Annexin V-PI法分别对转染后的Vero细胞及MDCK细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,转染阳性质粒的MDCK细胞凋亡率增高,而转染空载体pcDNA3.1(+)的MDCK细胞及转染的Vero细胞均无明显变化.表明,qNS1、rNS1蛋白在体外培养的MDCK细胞中表达并能够诱导其发生凋亡,而在Vero细胞中却不能发挥此功能.     

Ea3-1E与mChIL-15融合基因的构建及其真核表达质粒的免疫效果

应用重叠扩增PCR技术将鸡堆形艾美球虫子孢子表面抗原3-1E基因片段(Ea3-1E)与编码鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL-15)进行串联连接,并在这2个基因片段之间引入4个柔性连接肽SPGS,获得融合基因Ea3-1E-linker-mChIL-15。以pcDNA3.1(+)为载体构建并鉴定真核表达质粒pcD-NA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15。应用磷酸钙法将质粒体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光技术和免疫组织化学技术对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。将重组质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15、pcDNA3.1-Ea3-1E和pcDNA3.1分别于14和21日龄经腿部肌肉注射免疫SPF雏鸡,28日龄时,除非免疫非感染组外,各组感染5×104个堆形艾美球虫孢子化卵囊,观察真核表达质粒的免疫保护效果。结果显示,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后第30小时可检测到融合基因编码蛋白在293T细胞中的瞬时表达。与质粒pcDNA3.1-Ea3-1E相比,质粒pcDNA3.1-Ea3-1E-linker-mChIL-15二次免疫后可提供明显的抗球虫免疫保护效果,提高相对增重率(96.48%),降低卵囊排出率(68.35%),降低十二指肠病变记分等。抗球虫指数为183.78。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核表达载体的构建

应用限制性内切酶BamHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT-omp H切下,非定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切分析、PCR鉴定及序列测定,证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-ompH。将重组表达质粒转染至 COS7 细胞,经RT-PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测,证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

口疮病毒VEGF基因的原核表达及亚细胞定位

为了对口疮病毒(ORFV)VEGF基因进行原核表达和亚细胞定位研究,PCR扩增VEGF基因,并将其分别克隆至原核表达载体p ET-32a(+)和真核表达载体p EGFP-C3中。将原核表达重组质粒转化至E.coli Rosseta感受态细胞中,经IPTG诱导表达目的蛋白。将表达产物纯化后免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体血清,并利用琼脂扩散试验检测其效价。将真核表达重组质粒转染BHK21细胞,利用激光共聚焦观察VEGF蛋白在BHK21细胞中的亚细胞定位。结果表明:VEGF蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量大小约为33 ku。Western-blot结果表明,VEGF蛋白具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1∶8。VEGF蛋白在转染BHK21细胞后主要在细胞质中表达,且能够与制备的多抗血清反应。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了一定的基础。     

弓形虫GJS株致密颗粒6基因真核表达质粒的构建及在BHK-21细胞中的表达

根据GenBank数据库中弓形虫RH株GRA6基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增GRA6基因,导入真核表达载体pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO,转化大肠杆菌DH5α,经酶切、PCR及测序鉴定,将重组质粒转染BHK-21细胞。GFP标签证明质粒DNA成功转染到细胞中并得以表达,通过Western-blot分析,细胞裂解液中有一条约52 ku的条带,可被山羊抗弓形虫超免疫血清识别,大小与预测值相符。表明真核表达质粒pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO-GRA6中的GRA6基因在BHK-21细胞中获得表达且表达产物具有抗原性。     

牛浮舰蛋白-2在真核细胞中的表达与鉴定

采用基因重组法将牛浮舰蛋白-2(Flotillin-2)基因的整个开放阅读框(ORF)克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)/Myc-His(B),通过脂质体法将重组质粒转入中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,利用Western-blot分析目的基因的表达情况。为确定35ku的小蛋白来源,采用融合PCR法构建突变体,分别利用标签抗体和针对浮舰蛋白-2的抗体鉴定突变体表达蛋白的特性。测序结果表明,成功构建了Flotillin-2基因的全长ORF及其突变体mFlotillin-2的重组质粒。Western-blot结果显示,Flotillin-2基因的全长ORF在CHO细胞中表达时除出现与预期大小相一致的48ku目的蛋白带外,还有1个35ku的条带。基因序列分析发现,在第430~438位核苷酸存在1个似Kozak序列(CGCATGGGC)。将ATG突变成GCT(丙氨酸)后,Western-blot结果显示,突变前后35ku的小蛋白始终存在。本研究以pcDNA3.1(-)/Myc-His(B)为载体,实现了牛Flotillin-2基因的全长ORF的真核表达,证明了35ku小蛋白并不是由于重新起始翻译导致的,而可能是浮舰蛋白-2在翻译过程中的裂解产物。     

携带禽流感病毒DNA疫苗的减毒鼠伤寒沙门菌的免疫效力

将从重组质粒pVAX1-HA中扩增的HA基因和从pVAX1-HA-CpG中切出的HA-CpG基因分别克隆入pcDNA3.1(+)载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-HA-CpG。将上述重组质粒分别转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验检测发现HA基因可在COS-7细胞中表达。将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,构建成携带DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pcDNA3.1-HA)和SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)。将重组菌分别以5×109CFU口服免疫1日龄鸡2次,重组菌免疫组产生的小肠黏膜抗体效价与空载体组及油乳剂灭活疫苗组间存在显著差异。攻毒免疫保护结果表明,SL7207(pcDNA3.1-HA-CpG)免疫组与空载体组之间存在显著差异,而SL7207(pcDNA3.1-HA)免疫组则与空载体组间无显著差异,说明CpG可增强DNA疫苗的免疫效果。