皮肤切创愈合中caspase-3表达的免疫组化研究

目的探讨皮肤切创损伤愈合过程中,caspase-3在损伤区内的表达以及不同损伤时间caspase-3的变化规律。方法应用免疫组织化学技术对33例不同损伤时间小鼠皮肤切创组织中caspase-3的表达进行研究。同时以3例非切创小鼠皮肤组织做对照。结果伤后6h的损伤皮肤组织中可见少量中性粒细胞表达caspase-3,伤后12～24h,大部分浸润的中性粒细胞及部分单核细胞为caspase-3阳性。随伤后时间延长,caspase-3阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后0～3h,caspase-3阳性细胞比率较低,为(4.53±6.53)%,12h后逐渐增加,伤后3d达高峰,为(62.66±4.84)%,其后逐渐下降。结论小鼠皮肤损伤愈合过程中,caspase-3可能在诱导损伤区内中性粒细胞、单核巨噬细胞及成纤维细胞发生凋亡过程中发挥重要作用,同时,caspase-3的规律性表达可用于损伤时间的推断。     

大鼠骨骼肌损伤后PMN、MNC及FBC百分率与损伤时间关系

目的：研究大鼠骨骼肌机械性损伤后不同时间点多形核白细胞（polymorphonuclear leucocytes , PMN）、单个核细胞（mononuclear cells,MNC）及成纤维样细胞（fibroblastic cells,FBC）百分率的变化。方法建立大鼠骨骼肌机械性损伤动物模型,随机分为伤后6h、12h、1d、3d、7d、10d、14d及正常对照组。应用HE染色法和图像分析检测大鼠骨骼肌损伤后不同时间点PMN、MNC及FBC百分率。结果伤后6~12 h,损伤区内可见PMN和MNC浸润,PMN百分率达到峰值;伤后1 d,损伤区内主要以MNC浸润为主,MNC百分率达到峰值,而PMN百分率开始下降;伤后3~7 d,FBC百分率开始逐渐增加,PMN和MNC百分率则逐渐下降;伤后10~14 d,FBC百分率达到峰值。结论大鼠骨骼肌损伤区内PMN、MNC及FBC百分率呈时间规律性变化,有望成为骨骼肌损伤时间推断的参考指标。     

大鼠骨骼肌损伤后不同时间的病理学变化

目的观测大鼠-骨骼肌损伤后不同时间点的病理学变化,为损伤时间推断的研究和应用提供依据和参考。方法 SD大鼠40只随机分为实验组(35只)和对照组(5只),实验组用500g重的打击器打击大鼠右下肢,建立大鼠骨骼肌机械性损伤动物模型,并随机均分为伤后6h、12h、1d、3d、7d、10d、14d组。应用HE染色、Mallory染色和图像分析法观测大鼠骨骼肌损伤的病理学改变。结果伤后6h,损伤区骨骼肌变性、间质大量出血和炎细胞浸润;12h~1d,骨骼肌坏死,伴大量炎细胞浸润,以PMNs和MNCs为主,数量分别达到高峰;3d起,坏死骨骼肌被逐渐清除,PMNs和MNCs数量逐渐减少,FBCs和新生骨骼肌开始出现,少量胶原纤维形成;7d,FBCs和新生骨骼肌数量继续增多,伴新生血管生成和胶原纤维沉积;10d~14d,FBCs数量和胶原纤维沉积分别达到高峰。结论大鼠骨骼肌损伤区PMNs、MNCs和FBCs数量,以及胶原纤维沉积随损伤经过时间的规律性变化,可为损伤经过时间推断研究提供参考。     

小鼠皮肤切创愈合过程中caspase-6、-7表达的免疫组织化学研究

目的　观察皮肤切创损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内的表达及其变化规律。方法　应用免疫组织化学技术观察伤后不同时间小鼠皮肤切创组织中caspase 6、 7的表达 ,以非切创小鼠皮肤组织作对照。 结果　伤后 6h的损伤皮肤组织中可见少量多核粒细胞表达caspase 6、 7,伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为caspase 6、 7阳性。随伤后时间延长 ,caspase 6、 7阳性细胞以单核细胞及成纤维细胞为主。伤后 0～ 3h ,caspase 6、 7阳性细胞比率较低 ,12h后逐渐增加 ,伤后 3d达高峰 ,其后逐渐下降。 结论　小鼠皮肤损伤愈合过程中 ,caspase 6、 7在损伤周边区内中性粒细胞 ,单核细胞及成纤维细胞中表达 ,其时序性变化规律可望用于皮肤损伤时间的推断。     

大鼠皮肤挫伤修复过程中NFкB P65表达的研究

目的探讨皮肤挫伤修复过程中,核转录因子(NFкB)P65在挫伤区不同时间表达的变化规律.方法应用免疫组化技术对挫伤后0h、3h、6h、9h、12h、1d、3d、5d、7d、10d的大鼠皮肤挫伤组织中NFкB P65的表达进行研究.结果伤后3h,挫伤区内浸润的少量多核粒细胞的胞质中NFкB P65呈弱阳性表达,阳性率为(3.20%±0.15%);伤后6h,阳性表达增强,阳性率为(11.33%±0.88%);伤后12h,表达继续增强,阳性率(75.67%±0.82%);伤后1d,在浸润的几乎所有单核细胞和多核粒细胞的胞质和胞核中均可见NFкB P65呈强阳性表达,阳性率为(97.33%±0.88%),表达达高峰,以后逐渐下降.结论大鼠皮肤挫伤修复过程中,NFкB P65在挫伤后的炎症反应中发挥重要作用;同时,NFкB P65在挫伤区内多核粒细胞,单核细胞及成纤维细胞中的表达呈规律性变化,可对挫伤时间的推断提供参考.     

Nrf2蛋白在骨骼肌损伤修复中的时序性表达及作用

目的通过检测骨骼肌损伤后核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)蛋白的表达变化,探讨其在骨骼肌损伤修复过程中的表达变化规律及作用。方法取雄性SD大鼠腓肠肌内注射心脏毒素,制作骨骼肌损伤模型,分别取正常对照组和损伤后1h、4h、8h、12h、16h、1d、3d、5d、7d、9d、13d、17d、21d的损伤处组织,采用HE染色法观察骨骼肌损伤修复过程中的形态学变化,检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)相对含量,Western印迹法及免疫荧光染色检测Nrf2蛋白表达水平。结果大鼠骨骼肌损伤后,损伤区依次出现以中性粒细胞、单核细胞为主的炎症细胞浸润,损伤后5d大量新生肌细胞生成,至21d基本完成肌细胞修复。与正常对照组相比,大鼠骨骼肌损伤后:ROS相对含量仅第12h降低(P0.05);Nrf2蛋白16h表达升高(P0.05);Nrf2阳性核率在损伤后增多,16h~1d达到高峰,随后逐步减少,最后恢复至对照水平(P0.05)。结论 Nrf2蛋白参与了骨骼肌损伤修复的调控,Nrf2阳性核率随损伤时间呈时序性变化,可用于骨骼肌损伤时间的推断。     

大鼠挫伤骨骼肌中M1/M2型巨噬细胞时间相关性研究

目的研究大鼠骨骼肌挫伤后M1/M2型巨噬细胞浸润的动态变化规律结合组织学改变建立损伤时间推断方法。方法建立大鼠骨骼肌挫伤模型,挫伤后6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、144h、216h、336h为实验组,对照组不进行任何处理。采用HE染色法和免疫荧光多重染色方法观察骨骼肌挫伤后修复规律,运用全景组织细胞定量分析系统检测损伤区内单位面积细胞核数量、M1及M2型巨噬细胞数量和比例变化规律并建立与损伤时间的关系。结果在0.5mm×0.5mm范围内,M1型巨噬细胞比例在0.05±0.02~0.18±0.12且M2型巨噬细胞比例在0.02±0.01~0.04±0.02范围内时,推断该组织的损伤时间为伤后6h~48h;M1型巨噬细胞比例0.22±0.02且M2型巨噬细胞比例在0.09±0.02范围内时,推断该组织的损伤时间为损伤后60h;M1型巨噬细胞比例0.1±0.02且M2型巨噬细胞比例在0.16±0.07范围内时,推断该组织的损伤时间为损伤后144h;M1型巨噬细胞比例0.05±0.01~0.09±0.02且M2型巨噬细胞比例在0.07±0.02~0.09±0.01范围内时,推断该组织的损伤时间为损伤后216h~336h。结论大鼠挫伤骨骼肌中M1/M2型巨噬细胞时间相关性表达规律可作为损伤时间推断的新依据,结合病理组织学改变可进一步提高损伤时间推断的准确性。     

小鼠皮肤切创愈合过程中iNOS和eNOS表达的免疫组织化学研究

目的观察小鼠皮肤切创愈合过程中,iNOS和eNOS在损伤区及损伤周边区内的表达及其变化规律。方法小鼠背部制作全层切创,应用免疫组织化学技术观察伤后切创组织中iNOS和eNOS的表达,并和无切创的小鼠作为对照。结果损伤区及损伤周边区细胞,伤后3h的损伤皮肤组织中可见少量的多型核细胞表达iNOS和eNOS,伤后6～24h,大部分浸润的中性粒细胞和单核细胞为iNOS和eNOS阳性。随着时间的延长,iNOS和eNOS阳性细胞以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后3hiNOS的阳性细胞比率较低,6h～1d持续性增加并于1d达到最高峰,3～7d维持在一个相对稳定的水平直至伤后10d再次达高峰,10～14d开始下降。eNOS的阳性细胞率在伤后1～3h表达较低,6h～3d持续性增高,并在3d达到最高峰,在其后的5d内保持稳定表达,之后开始下降。而且损伤区及损伤周边区、特别是肉芽组织内的新生血管可见iNOS和eNOS不同强度的表达。结论小鼠皮肤切创愈合过程中,iNOS和eNOS在损伤周边区内多型核细胞、单核细胞和成纤维细胞中表达,其时序性变化可望用于皮肤损伤时间的推断。     

大鼠皮肤挫伤修复过程中NF_κB P65表达的研究

目的探讨皮肤挫伤修复过程中,核转录因子(NFkB)P65在挫伤区不同时间表达的变化规律。方法 应用免疫组化技术对挫伤后0h、3h、6h、9h、12h、1d、3d、5d、7d、10d的大鼠皮肤挫伤组织中NFkB P65的表达进行研究。结果伤后3h,挫伤区内浸润的少量多核粒细胞的胞质中NFkB P65呈弱阳性表达,阳性率为(3.20％±0.15％);伤后6h,阳性表达增强,阳性率为(11.33％±0.88％);伤后12h,表达继续增强,阳性率(75.67％±0.82％);伤后1d,在浸润的几乎所有单核细胞和多核粒细胞的胞质和胞核中均可见NFkB P65呈强阳性表达,阳性率为(97.33％±0.88％),表达达高峰,以后逐渐下降。结论 大鼠皮肤挫伤修复过程中,NFkB P65在挫伤后的炎症反应中发挥重要作用;同时,NFkB P65在挫伤区内多核粒细胞,单核细胞及成纤维细胞中的表达呈规律性变化,可对挫伤时间的推断提供参考。     

人皮肤组织刺、切创后IL-8表达的免疫组织化学研究

为探讨人皮肤刺、切创后白细胞介素 8(interleukin 8,IL 8)在推断皮肤损伤时间中的应用价值 ,本研究应用免疫组化技术对 5 2例不同损伤时间人体皮肤刺、切创组织中IL 8的表达进行了研究。伤后 4h的损伤皮肤组织中可见部分的多核粒细胞表达IL 8。伤后 12～ 2 4h ,大部分浸润的多核粒细胞及部分单核细胞为IL 8阳性。随伤后时间延长 ,IL 8阳性细胞以单核及成纤维细胞为主。伤后 4～ 6h的皮肤中 ,IL 8阳性细胞比率较低 ,为 16 0±10 1%。伤后 1～ 4d达高峰 ,为 5 9 6± 8 7%。其后逐渐减少。本研究结果表明 ,IL 8的表达可用于皮肤刺、切创后损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创愈合过程中c-jun的表达

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区c-jun的表达及不同损伤时间c-jun的变化规律。方法应用免疫组织化学染色和Western印迹技术检测小鼠皮肤切创后各个时间段c-jun的表达变化情况。结果正常组织中有少量c-jun表达。伤后3～12h损伤区c-jun主要表达在中性粒细胞中,1～5dc-jun阳性细胞主要以单个核细胞和成纤维细胞为主,7～14dc-jun主要在成纤维细胞中表达。阳性细胞率3～12h逐渐增高,12h达高峰,1～5d有所下降,7d阳性细胞率达第二峰值,10～14d逐渐降低。Western印迹法检测显示各个时间段均有c-jun阳性条带,其中12h和7d为c-jun含量的2个高峰。结论小鼠皮肤切创愈合过程中c-jun在损伤区对诱导中性粒细胞、单个核细胞及成纤维细胞的凋亡可能起着重要作用,同时c-jun表达的规律性变化可用于损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创黏着斑激酶和磷酸化黏着斑激酶的表达及其变化规律

目的研究小鼠皮肤切创愈合过程中,黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）和磷酸化黏着斑激酶（phospho—FAK,p—FAK）在损伤区及损伤周边区内的表达及其变化规律。方法应用免疫组织化学染色技术和免疫印迹（Western blot）方法观察小鼠背部切创后损伤区及损伤周边区FAK及p-FAK的表达情况。结果伤后3h,FAK和p-FAK主要表达于多核粒细胞;伤后6～24h,主要表达于大部分浸润的多核粒细胞和单核细胞;伤后3～14d。主要表达于单核细胞和成纤维细胞。伤后FAK的阳性细胞率逐渐增高．于3d达到高峰．随后迅速下降;伤后p-FAK的阳性细胞率也逐渐增加,于12h达到高峰,之后逐渐下降。Westernblot结果显示,正常皮肤中FAK及P—FAK均有表达。FAK表达强度变化不是十分明显,但仍可见在3d时含量达到最高。p-FAK蛋白含量伤后逐渐增加．12h表达最强,随后逐渐下降。结论在小鼠皮肤切创愈合过程中,FAK和p-FAK阳性细胞率呈时间规律性变化．可用于皮肤切创损伤时间的推断。p-FAK呈现出明显的时间规律性变化,说明作为皮肤损伤时间的推断指标要优于FAK。     

小鼠皮肤切创愈合过程中p-JNK变化及其与时间的相关性

目的 探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区磷酸化JNK（p-JNK）的变化及不同损伤时间p-JNK的变化规律。方法 应用免疫组织化学和Westernblot方法检测小鼠皮肤切创后各个时间段p-JNK的变化情况。结果 正常组织中有少量p-JNK阳性着色。伤后3～12h损伤区p-JNK阳性着色主要在中性粒细胞,1～5dp-JNK阳性着色主要为单核细胞和成纤维细胞,7～14dp-JNK阳性着色以成纤维细胞为主。阳性细胞率3h～1d逐渐增高,1d达到峰值,3～5d有所下降,7d阳性细胞率达第二峰值。10～14d逐渐降低。Westernblot显示各个时间段均有p-JNK的阳性条带,其中12h和3d为p-JNK含量的2个高峰。结论 小鼠皮肤切创愈合过程中p-JNK在损伤区对诱导中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的凋亡起非常重要的作用。同时P-JNK的规律性变化可用于损伤时间推断。     

大鼠皮肤挫伤修复过程中caspase-6的表达及其时间规律性

目的探讨皮肤挫伤修复过程中,caspase-6在挫伤区及挫伤周边区不同时间表达的变化规律。方法应用免疫组化染色、Westernblot技术显示caspase-6在皮肤挫伤区及挫伤周边区炎性细胞中的阳性表达和激活情况。结果伤后3h,挫伤区内浸润的少量多核粒细胞的胞质中caspase-6呈弱阳性表达,阳性率为(25.78±1.38)%;伤后12h,阳性表达增强明显,阳性率为(47.70±5.14)%;伤后3d,几乎所有多核粒细胞、单核细胞和成纤维细胞中caspase-6呈强阳性表达,阳性率为(54.58±5.64)%,表达达高峰,以后逐渐下降。Westernblot实验证明,caspase-6酶原表达呈现时间规律性变化。结论大鼠皮肤挫伤修复过程中,caspase-6在挫伤后的炎症反应中发挥重要作用;同时,caspase-6在挫伤区内多核粒细胞、单核细胞及成纤维细胞中的表达呈规律性变化,可对挫伤时间的推断提供参考。     

大鼠脑液压冲击伤caspase-8的表达

目的探讨大鼠脑损伤后caspase-8表达情况,为脑损伤的诊断及损伤时间推断提供依据。方法建立大鼠脑液压冲击伤模型。用免疫组化与图像分析技术分别检测伤后15,30min和1,3,6,12h及1,4,7,14d大鼠皮质、丘脑、海马等部位caspase-8的表达。结果发现伤后30min大脑皮质和海马caspase-8开始出现表达,随时间增加其表达亦逐渐增加,伤后3h显著增加,24h达到高峰,4d后逐渐减少,14d基本恢复正常;而丘脑在伤后1h才开始出现阳性表达,伤后6h出现明显表达,24h达到高峰,4d后逐渐减少,14d基本恢复正常。同时发现损伤对侧海马及丘脑出现相应的变化规律。结论caspase-8阳性表达的变化规律可作为脑损伤诊断及损伤时间推测的指标之一。     

大鼠骨骼肌挫伤后p-CB1R的表达及与损伤时间的相关性

目的观察探讨大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中p-CB1R的表达规律与损伤时间的相关性。方法健康成年雄性SD大鼠50只,体重220～250g,随机分为10组,每组5只,其中9组为实验组,1组为正常对照组。应用免疫组织化学染色和Western blot技术,检测50例大鼠骨骼肌挫伤后各时间段p-CB1R的表达情况。结果正常对照组大鼠骨骼肌未见p-CB1R表达;挫伤后p-CB1R阳性表达主要在单核细胞和成纤维细胞中,各时间段大鼠骨骼肌均未见阳性反应。伤后3～24h,阳性细胞以单核细胞为主;3～5d,阳性细胞以单核细胞和成纤维细胞为主;7～10d,阳性反应主要见于成纤维细胞,并于7d达到高峰;14d,p-CB1R阳性表达量有所下降。结论骨骼肌挫伤愈合过程中p-CB1R在单核细胞和成纤维细胞中的变化具有时序性,可望作为法医学推断骨骼肌挫伤时间的参考指标之一。     

小鼠皮肤切创愈合过程中磷酸化 p38MAPK 表达及其与时间的相关性

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的表达情况,以及不同损伤时间p-p38MAPK的变化规律。方法应用免疫组织化学和Westernblot的方法检测33例小鼠皮肤切创后各个时间段p-p38MAPK表达情况。结果正常组织中有少量的p-p38MAPK表达。伤后3～12h损伤区p-p38MAPK主要表达于中性粒细胞中,1～5dp-p38MAPK阳性表达主要为单核细胞和成纤维细胞。7～14dp-p38MAPK阳性表达主要以成纤维细胞为主。阳性细胞率3～12h逐渐升高,1d有所下降,3、5d阳性细胞率保持在高水平,7～14d阳性细胞率逐渐降低。Westernblot显示各个时间段均有p-p38MAPK的表达。其中12h和3d为2个p-p38MAPK含量的高峰。结论在小鼠切创愈合过程中p-p38MAPK在损伤区对诱导中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的凋亡起重要的作用,同时p-p38MAPK的规律性表达可用于损伤时间的推断。     

小鼠皮肤切创愈合过程中大麻素Ⅰ型受体表达

目的探讨小鼠皮肤切创愈合过程中损伤区大麻素Ⅰ型受体（cannabinoid receptorⅠ,CB1R）的表达及不同时间的变化规律。方法应用免疫组织化学和Western印迹法检测小鼠皮肤切创后不同时间段CB1R的变化情况。结果正常组织中有少量CB1R的表达,位于表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层。伤后6～12 h,中性粒细胞不表达CB1R,伤后1～5 d,阳性染色以单核细胞和成纤维细胞为主。伤后7～14 d,CB1R阳性着色以成纤维细胞为主。阳性细胞率6h～3d逐渐升高,5d达到高峰,7～14d逐渐降低。经Western印迹法显示各个时间段均有CB1R的阳性条带,其中5d为CB1R表达的高峰。结论在皮肤损伤愈合过程中CB1R被激活,CB1R表达于单核细胞,可能参与炎症反应,CB1R在损伤周边区表达于成纤维细胞,可能参与皮肤损伤后的愈合,其变化规律可用于损伤时间的推断。     

大鼠撞击性肝挫伤后MMP-2和MMP-9蛋白时序性表达

目的观察大鼠撞击性肝挫伤后不同时间肝组织中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2和MMP-9的蛋白表达规律。方法选取健康成年雄性SD大鼠50只,随机平均分入对照组和伤后1 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、3 d、5 d、7 d组。采用自由落体撞击法建立大鼠肝挫伤模型,在相应时间点处死大鼠,提取挫伤的肝叶,运用免疫组织化学染色法(SP法)和Western印迹法观察各组大鼠肝组织内MMP-2和MMP-9的蛋白表达情况。结果肝挫伤后,阳性细胞表达和蛋白半定量结果显示:MMP-2在伤后6 h表达开始增强,24 h达到峰值,3~5 d逐渐下降,7 d时接近正常水平,损伤6 h后各组(除18 h组)与相邻上组比较,差异均有统计学意义(P0.05);MMP-9在伤后1 h即明显上升,18 h达到高峰,3~7 d时逐渐下调,但仍高于对照组,伤后各组(除12 h、24 h组)与相邻上组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 MMP-2和MMP-9的蛋白表达在撞击性肝挫伤组织中有较好的时序性,有望作为肝挫伤的时间推断的参考指标。     

大鼠骨骼肌挫伤后ASCT2 mRNA的表达变化

目的应用实时定量PCR技术检测大鼠骨骼肌挫伤后细胞中性氨基酸载体ASCT2 mRNA表达,分析其与挫伤时间的关系。方法建立大鼠骨骼肌挫伤模型,分别取伤后4、8、12、16、20、24、28、32 h及对照组检材。提取总RNA,逆转录合成第一链的cDNA,以RPL13为内参基因进行荧光定量检测,采用2-△△Ct法比较其与对照组肌肉组织中ASCT2 mRNA的相对表达量。结果损伤组肌肉组织中ASCT2 mRNA在挫伤后12、16h表达量分别为对照组的196.40%和189.15%,损伤后4、8、20、24、28、32h ASCT2 mRNA表达量与对照组相比无统计学差异(P>0.05),说明ASCT2 mRNA在损伤12～16h其表达量较正常组及其他损伤时间组要高,而在损伤20h以后ASCT2 mRNA表达量又降至正常水平。结论大鼠骨骼肌挫伤后32h之内ASCT2 mRNA的表达有一定的时间规律性,可望作为推断骨骼肌损伤时间的指标之一。