大熊猫轮状病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的大熊猫轮状病毒(RV)VP7基因序列,设计了1对特异性引物,建立了快速检测大熊猫RV的RT-PCR方法.用该方法对MA-104细胞增殖的大熊猫RV进行RT-PCR扩增,结果得到与试验设计相符的342 bp的特异性扩增条带,而对传染性胃肠炎病毒、大肠杆菌和沙门氏菌的扩增结果为阴性.测序比对结果证实该体系检测结果准确;该方法最低可检测出约1 pg的病毒核酸;重复性试验结果显示,其检测重复性好,提示该RT-PCR方法可用于大熊猫RV的临床快速检测.     

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物,其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物,另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物,通过对多重RTPCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RTPCR技术。特异性和敏感性试验结果表明,该技术对AIVH5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段;对AIVH7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段;对AIVH5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段;对其他AIVHA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段;对其他常见禽病病原扩增均为阴性;该多重RTPCR对AIVRNA、AIVH5和AIVH7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100pg。     

PCV2-PRV-PRRSV-CSFV多重PCR检测方法的建立

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的有关基因序列,设计4对引物分别用于扩增PCV2的ORF2基因、PRV的gH基因、PRRSV的ORF7基因和CSFV的5′UTR基因的目的片段,建立了同时检测4种病毒的多重PCR。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对这4种病毒的最低核酸检出量分别为48.1pg(PCV2)、29.6pg(PRV)、54.2pg(PRRSV)和62.8pg(CSFV)。该方法可同时扩增440bp(PCV2)、359bp(PRV)、321bp(PRRSV)和186bp(CSFV)的特异性片段,而对牛流行性腹泻病毒、猪流行性腹泻病毒和猪细小病毒的检测结果均为阴性。多重PCR与单一PCR的符合率为100%。结果表明,该方法可用于这4种病毒的临床快速检测与流行病学调查。     

用多重PCR鉴别猪伪狂犬病野毒与疫苗毒的研究

根据基因库中的猪伪狂犬病病毒(PRV)各基因的序列,设计了与PRV的 gB、gD、gE基因序列互补的3对引物。对样品中的PRV DNA模板进行了多重PCR扩增及反应条件的优化,结果同时得到与设计相符合的3条特异性条带,分别为549 bp(gB)、429 bp(gD)、366 bp(gE)。用这3对引物对三基因缺失疫苗毒的样品DNA模板进行多次多重 PCR扩增,均能稳定得到与设计相符合的2条特异性条带。敏感性试验结果表明,多重 PCR可以检测到 106 pg三基因缺失疫苗毒或756 pg PRV野毒的核酸模板量。特异性试验结果表明,以正常对照细胞及猪圆环病毒和猪细小病毒DNA为模板进行多重PCR扩增,均无任何条带。     

猪传染性胃肠炎病毒半巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种高效、敏感、特异的用于检测猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的半巢式RT-PCR方法,本研究依据GenBank发表TGEV的N基因序列设计3条特异性引物,通过优化反应体系,建立了检测TGEV的半巢式RT-PCR方法,并对反应体系特异性和敏感性进行了检测。结果显示,该方法能够成功扩增483 bp和338 bp两条目的条带;对TGEV具有良好的特异性,与猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪博卡病毒、猪德尔塔冠状病毒均无交叉反应;最低可检测到1.86×10~(-1)pg/μL的TGEV cDNA。用所建半巢式RT-PCR对临床50份猪腹泻样品进行检测,结果显示,阳性率为36%,高于普通RT-PCR阳性检出率,且阳性样品符合率为100%。本试验所建立的半巢式RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性好,可准确地对TGEV感染做出诊断,为TGEV的临床检测、流行病学调查提供了有效手段。     

犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白基因序列,设计合成了1对特异性引物,以CDV疫苗株ONP为模板,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测CDV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RT-PCR扩增,能得到与理论设计值大小一致的242bp的特异性条带;该方法最低可以检测出约20pg含量的CDV;对已知CDV阳性和阴性病料进行重复性和稳定性试验,结果均一致;用该方法检测犬细小病毒(CPV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)和同为副黏病毒科的新城疫病毒(NDV),均无交叉反应;对32份临床病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测试纸检测结果进行比较,符合率为93.75%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,重复性和稳定性均好,可用于犬瘟热病毒的临床诊断和试验研究。     

PEDV-TGEV-RV三重PCR检测方法的建立

根据G en Bank中已登陆的猪流行性腹泻病毒(PED V)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(RV)的参考基因序列,设计3对引物分别用于扩增PEDV的N基因、TGEV的M基因、RV的VP7基因的目的片段;通过优化反应体系,建立了同时检测PEDV、TGEV、RV的三重PCR检测方法。敏感性和特异性试验的结果表明,该方法对这3种病毒的最低核酸检出量分别为39.5 pg(PEDV)、38.1 pg(TGEV)和51.6 pg(RV)。该方法可同时扩增477 bp(PEDV)、263 bp(TGEV)、355 bp(RV)的特异性基因片段,而对猪瘟病毒(CSF V)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)等病毒的检测结果均为阴性。三重PCR与单一PCR的符合率为100%。上述结果表明,该方法的建立对于这3种病毒的临床快速检测与流行病学调查具有十分重要的意义。     

丝状霉形体山羊亚种巢式PCR检测方法的建立

根据已发表的丝状霉形体簇各成员核苷酸序列,设计合成了2对引物McF、McR和MmcF、MmcR,建立了可以鉴别丝状霉形体山羊亚种(Mycoplasma mycoidessubsp.capri,Mmc)的巢式PCR方法。特异性和敏感性试验结果显示,该方法只能对Mmc扩增出195 bp的片段,而对其他病原菌不能扩增出任何条带,它最低能够检测出10 pg的Mmc DNA,说明该方法具有良好的特异性和很高的敏感性。田间试验结果显示,对4株霉形体分离株及其病料均可扩增出Mmc特异性片段,表明,该巢式PCR方法可用于Mmc快速鉴定和流行病学调查。     

犬圆环病毒及犬细小病毒双重PCR检测方法的建立

为建立能同时检测犬圆环病毒(CanineCV)和犬细小病毒(CPV)的方法,根据CanineCV和CPV基因组的保守区域设计2对特异性引物,预期特异性扩增CanineCV和CPV的片段大小分别为984和668 bp。并将反应条件进行优化,建立了CanineCV和CPV的双重PCR检测方法。特异性检测结果显示,该方法能特异性扩增CanineCV和CPV的目的条带,且未扩增出其他犬胃肠道病原;CanineCV和CPV的最低检出限分别为85.7和312 copies/L。对采集自广西地区的223份临床样品的检测结果显示,CanineCV的阳性率为2.24%(5/223)、CPV的阳性率为5.38%(12/223),后者与常规PCR检测方法相一致。结果表明,建立的双重PCR方法可以用于CanineCV和CPV的检测和流行病学调查。     

多重RT-PCR快速检测鉴别新城疫病毒强毒株和弱毒疫苗株方法的建立

根据新城疫病毒(NDV)基因结构的特点及强、弱毒株融合基因裂解位点的序列差异设计了4条引物,建立了一种可以快速鉴别NDV强毒株和弱毒疫苗株的多重PCR方法。检测结果显示,强毒株可以扩增出442 bp的特异性片段和671 bp的通用片段,弱毒疫苗株可以扩增出252bp的特异性片段和671 bp的通用片段。该方法只需进行一次RT-PCR,整个过程可在数小时内完成。经敏感性测定,该方法最低能检测到100 pg的NDV RNA。     

应用多重PCR检测和区分3个型的马疱疹病毒

针对马疱疹病毒(EHV)的EHV-1、EHV-2和EHV-4糖蛋白B基因序列,设计、合成了3对特异性引物进行多重PCR,不仅可以在数小时内分别检测这3个型的EHV,而且在同一反应系统内可以清晰地区分EHV-1、EHV-2和EHV-4,其PCR产物大小分别为226、3335、70bp,符合预期的片段大小,序列分析证实与已发表的序列一致;该检测方法的灵敏度达到103TCID50;分别从血清学阳性但病毒分离为阴性的1匹进口马组织样品和一些出口前检疫马的鼻咽样品检测到EHV-1和EHV-4特异性核酸。     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

应用多重聚合酶链反应检测四种霉形体的研究

根据鸡毒霉形体 (MG)、滑液囊霉形体 (MS)、衣阿华霉形体 (MI)和火鸡霉形体 (MM )的基因文库 ,设计了 4对分别与MG、MS、MI和MM某段基因序列互补的引物 ,用这 4对引物对同一样品中的MG、MS、MI和MM的DNA模板进行多重PCR扩增。结果 ,均同时得到了 4条特异性的大小与试验设计相符的 732bp(MG)、2 0 7bp(MS)、2 99bp(MI)、85 0bp(MM )多重PCR扩增带 ,而对其他 6种禽病病原体的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明 ,此多重PCR能同时检出 1pg的MG、MS、MI和MMDNA模板     

产蛋下降综合征病毒PCR检测方法的建立

根据已报道的腺病毒DNA序列 ,设计合成了 1对核苷酸引物 ,引物间隔约 63 0bp。用该引物对EDS76病毒内蒙古分离株 (N3 ,N4 )和参考株 (AV 1 2 7)核酸进行聚合酶链式反应 (PCR)。结果 ,均扩增出了约 63 0bp的特异性DNA片段。所建立的PCR方法可检出 1 0 0pg的样品模板。结果表明 ,此PCR方法是检测EDS76病毒的一种简便快速、特异性强和灵敏度高的方法     

利用PCR检测鸭瘟病毒

参照文献 ,设计和合成了 1对引物。用这对引物 ,以标准毒株DPVF3 4的DNA为模板 ,经PCR扩增出 1个特异的DNA片段。经序列测定 ,该DNA片段由 42 0bp组成。与文献报道的序列比较 ,该片段为鸭瘟病毒UL6基因DNA的一部分 ,与美国毒株LakeAndes(LA)的同源性达 99%。用该PCR方法扩增小鹅瘟病毒、细小病毒和禽巴氏杆菌 ,结果为阴性。以该PCR方法检测 6份送检病料 ,5份为阳性 ,检出率与病毒的分离一致。另外 ,该方法检测DPVDNA的敏感性达到了 1pg水平     

马疱疹病毒糖蛋白G基因C-末端的原核表达

为获得马疱疹病毒1型(EHV1)和4型(EHV4)糖蛋白G(gG),对克隆载体pMD-1gG和pMD-4gG分别进行BamHⅠ+SalⅠ和EcoRⅠ+HindⅢ双酶切,将所得片段分别插入表达载体pGEX-6P-1和pET28a(+)中,构建了重组质粒pGEX-1gG和pET-4gG。经双酶切和序列鉴定为阳性后,将重组质粒pGEX-1gG转化入大肠杆菌BL21(DE3)、重组质粒pET-4gG转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导表达后对表达产物进行SDS-PAGE分析。结果显示,分别在35和17ku处出现与预期大小相符的目的条带。Western-blot结果证实,目的蛋白均具有良好的反应原性。表明,成功实现了EHV1gG和EHV4gG蛋白的正确表达,初步鉴定其具有良好的反应原性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。     

PCR检测鸡毒霉形体和鸡滑液囊霉形体的研究

根据禽霉形体 16SrRNA的基因序列设计、合成了 1对引物 ,用这对引物对鸡毒霉形体 (Mycoplasmagallisep ticum ,MG)和鸡滑液囊霉形体 (Mycoplasmasynoviae ,MS)菌株DNA进行PCR扩增 ,得到了与预期大小相一致的约 5 80bp的PCR产物 ,而这对引物对其他禽病病原DNA或RNA模板的扩增结果为阴性。PCR方法对MG和MS的最小检出量分别为 2 pg和 3pg。应用已建立的PCR方法检测MG人工感染样品和临床样品 ,从人工感染样品中均检测到MG ,临床样品的MG阳性检出率为 10 .2 5 % ,高于常规分离培养的阳性检出率     

鹅细小病毒强毒PCR检测方法的建立

参照GenBank中登录的鹅细小病毒 (GPV)B株的全基因序列 ,针对GPV的VP3保守基因设计了 1对引物 ,建立了GPV的PCR检测方法。采用该方法检测GPV能够扩增出预期大小约 4 41bp的特异性片段 ,而对鸭瘟病毒 (DPV)、鹅源致病性大肠埃希氏菌 (E .coli)O8和O1、雏鹅新型病毒性肠炎病毒 (NGVEV)呈阴性反应。该法检测GPV核酸的灵敏度可达 0 .4 7pg ;对GPV强毒皮下注射感染雏鹅各器官的检测结果表明 ,感染后 8h即可从心、肝病料中检出病毒DNA ,感染后 2 4h可从延髓、胸腺、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠、腔上囊、心、肝、脾、肺、肾、血液、小脑、直肠、肌肉、粪便中检出GPVDNA ,感染 4 8h后可从骨髓中检出病毒DNA ,感染 312h后仍能从十二指肠、空肠、盲肠、心、肝、肾、粪便中检出病毒DNA。病毒分离阳性的可疑病料PCR检测为阳性 ,对临床送检病料的检测结果表明 ,PCR的敏感性显著高于病毒分离。