不同佐剂乳牛乳腺炎多联灭活疫苗的免疫试验

用 4种不同佐剂乳牛乳腺炎多联疫苗进行兔免疫攻毒试验。结果 ,蜂胶疫苗效果最好 ,铝胶疫苗次之。对昆明系小白鼠注射蜂胶疫苗和铝胶疫苗后第 30d金黄色葡萄球菌抗体水平达到最高 ,无乳链球菌和停乳链球菌抗体在第 2 1d达到峰值。在免疫健康泌乳牛的试验中 ,3种佐剂疫苗的免疫效果依次为蜂胶疫苗、油疫苗和铝胶疫苗 ;与对照组相比 ,免疫效果均显著 (P <0 .0 5 )。     

CpG ODN增强猪囊尾蚴病疫苗免疫反应的试验研究

依据CpG基序的生物学和免疫学特性 ,人工设计合成了硫代修饰的多种CpGODN序列 ,通过兔、小鼠和猪体进行了与铝胶、2 0 6佐剂和蜂胶佐剂的配伍和比较试验 ,用ELISA法测定加单一佐剂或联合佐剂组疫苗诱导的抗猪囊尾蚴病的抗体含量 (IgG或IgG2a)和效价 ,用MTT淋巴细胞转化试验法测定刺激指数 ,进一步证实了CpG基序的种类、数量和空间结构以及与其他佐剂联合对疫苗免疫反应的影响 ,CpG基序以 1个TpC的 5′端开始 ,紧接着 3个GTCGTT基序 ,基序与基序之间由TpT或T分隔 ,在兔、小鼠和猪都能诱导机体产生强烈的免疫反应特别是细胞免疫反应。     

犬瘟热灭活疫苗与弱毒疫苗免疫效果的研究

为对犬瘟热病毒(CDV)灭活疫苗的免疫效果进行研究,本试验使用2%的二乙烯亚胺(BEI)常温下灭活CDV-L弱毒株28 h,经检测,该条件下CDV病毒灭活完全。将灭活病毒分别与氢氧化铝佐剂和脂肪乳佐剂以9∶1混合制成佐剂灭活疫苗。将制备的上述佐剂灭活疫苗和CDV-L弱毒活疫苗分别接种SPF级试验大鼠,分别于接种前第1周、接种后第1周、第2周、第1月、第2月、第6月、第9月这几个时间点采集大鼠血清,通过间接ELISA和血清中和法测定抗体效价。结果显示,制备的佐剂灭活疫苗间接ELISA抗体效价最高达1.026 6和1.056 2,血清中和效价最高达4 197和3 762,免疫时效长约9个月,弱毒活疫苗间接ELISA抗体效价最高为0.176 3,血清中和效价最高为1 877,免疫时效约为6个月。BEI灭活疫苗的抗体效价及免疫时效均高于弱毒活疫苗。     

壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型口蹄疫VLPs免疫豚鼠的免疫增强作用

为了探索壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)的免疫增强作用,本研究利用O型口蹄疫病毒(FMDV)的病毒样颗粒作为抗原,通过Chitosan A或者加入白油后制成的混合乳Chitosan B两种壳聚糖凝胶微球与VLPs配伍免疫豚鼠,免疫后测定被免疫豚鼠的T淋巴细胞增殖情况,检测FMDV特异性抗体水平,观察计算攻毒后保护率。结果,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球能够诱导豚鼠产生高水平的FMDV特异性抗体,T淋巴细胞增殖效果高于ISA201佐剂。此外,Chitosan B佐剂组优于Chitosan A佐剂组。上述结果说明,壳聚糖季铵盐凝乳胶微球对O型FMD VLPs具有免疫增强作用,可以诱导VLPs的体液免疫和细胞免疫应答;壳聚糖季铵盐凝乳胶微球是一种具有潜力的疫苗佐剂,可以成为FMDV疫苗的候选佐剂。     

重组免疫融合肽Tα1-BP5对鸭坦布苏病毒灭活疫苗的免疫增强作用

为研究重组融合肽Tα1-BP5(rTα1-BP5)对鸭坦布苏病毒灭活疫苗的免疫增强作用,本试验以rTα1-BP5联合鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫雏鸭,检测免疫后鸭的Ig G抗体、细胞因子(IL-4和IFN-γ)的分泌水平、淋巴细胞增殖水平和血清病毒中和抗体效价,并通过攻毒试验评价其对雏鸭的免疫保护作用。结果显示,rTα1-BP5能够增强机体免疫后Ig G抗体和细胞因子的分泌水平,增强淋巴细胞的增殖水平,提升血清病毒中和抗体效价。结果表明,rTα1-BP5能够增强机体细胞和体液免疫应答水平;动物免疫保护试验结果显示,rTα1-BP5配合鸭坦布苏病毒灭活疫苗免疫雏鸭后增强了对肝的免疫保护作用。本研究为鸭坦布苏病毒灭活疫苗的新型佐剂研究开发奠定了基础。     

化学佐剂对猪瘟病毒E_2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明小白鼠为试验动物,研究了化学佐剂对猪瘟病毒E2 囊膜糖蛋白( HCV E2) 基因疫苗的免疫增强作用;用印度墨水活体染色法筛选促进印度墨水在肌肉中扩散的化学试剂,并用筛选到的化学试剂与pCDLacZ 混合肌肉注射小白鼠。结果表明,斯苯和甘油能较好的促进LacZ 基因在小白鼠胫前肌中表达,提示斯苯和甘油可作为基因疫苗的化学佐剂;用斯苯和甘油按比例混合配制HCV E2 基因疫苗质粒pCDST 免疫小白鼠,其抗体效价显著高于蔗糖、甘油、斯苯单一佐剂。     

产气荚膜梭菌β毒素和ε毒素以及腐败梭菌α毒素三联基因工程灭活疫苗的制备与免疫效力评价

为了获得高表达量的重组C型产气荚膜梭菌β毒素,鉴定其致死性和反应原性,并评价其与D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素共表达产物联合制成三联基因工程灭活疫苗的免疫保护效力。设计含不同酶切位点的2对引物,PCR扩增C型产气荚膜梭菌β毒素基因cpb1和cpb2,将二者克隆至pRSFDuet-1质粒,转化大肠杆菌BL21 (DE3),自诱导培养基诱导2段基因共表达。用SDS-PAGE和Western-blot以及小鼠毒性试验、抗毒素血清和中和试验对表达产物进行鉴定。将诱导收获的大肠杆菌以及D型产气荚膜梭菌ε毒素和腐败梭菌α毒素的共表达产物1∶2配比灭活制成三联灭活铝佐剂疫苗,以每只1 m L剂量皮下免疫家兔2次后,测定血清中和抗体效价,用1 MLD的C、D型产气荚膜梭菌毒素和腐败梭菌毒素分别攻击。结果显示,所构建的重组大肠杆菌BL21(pRSFDuet-cpb1-cpb2)能够表达重组β毒素,产物能够与C型产气荚膜梭菌抗毒素血清反应,且具有小鼠致死毒性,抗毒素血清可以将其毒性中和;制成联合疫苗免疫家兔,免疫血清对C型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为8 MLD/0.1 m L,对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价为45 MLD/0.1 m L,对腐败梭菌毒素的中和抗体效价为1.5 MLD/0.1 m L;用3种毒素攻击免疫组家兔均全部保护,对照组全部死亡,达到《中华人民共和国兽药典三部(2015版)》效力检验标准。本研究为羊猝狙、肠毒血症和快疫三联疫苗的研制提供了试验基础。     

犬冠状病毒压力灭活苗的制备与应用研究

使用静水压高压灭活的方法制备犬冠状病毒(CCV)蜂胶佐剂灭活苗,将此灭活苗免疫接种易感犬,同时以CCV甲醛灭活苗作对比试验.结果表明,CCV压力灭活苗安全可靠,其诱导试验犬产生中和抗体的能力明显高于该病毒的甲醛灭活苗,临床应用证明该灭活苗可以控制犬冠状病毒性肠炎的发生与流行.     

小熊猫接种犬瘟热疫苗后的抗体检

以犬用犬瘟热（ＣＤ）弱毒疫苗接种从产地新引入南京市玄武湖动物园的２只小熊猫（Ａ组），在接种后１１个月内每月采血１次，用微量中和试验检测其体内抗犬瘟热病毒（ＣＤＶ）抗体效价。结果显示，小熊猫接种后１个月时抗体效价已达１∶１０００左右，２个月时效价最高，达１∶２０００左右，而后缓慢下降，至７和１１个月时分别约为１∶１００和１∶２０。同时检测了以前接种过同一疫苗的３只该动物园自己繁育的小熊猫（Ｂ组）和福州市动物园内的６只小熊猫（Ｃ组）的ＣＤＶ中和抗体效价，其效价变化类似于Ａ组。这些小熊猫在接种前均确认健康，在试验期间同样的饲养条件下未发生ＣＤ，提示犬用ＣＤ疫苗可用于小熊猫的ＣＤ预防，其产生的有效免疫力至少可持续６个月。     

基因Ⅰ型乙脑病毒EDⅢ结构域蛋白的原核表达及其抗体制备与鉴定

为了分析和验证作为乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)亚单位疫苗研制的主要候选抗原EDⅢ结构域的免疫原性及其所产生的抗体对病毒的抑制效果,本研究利用RT-PCR方法扩增基因Ⅰ型JEV GS株EDⅢ结构域基因,构建原核重组表达载体p ET-30a-EDⅢ,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,挑取阳性克隆进行诱导表达和纯化;将纯化的EDⅢ重组蛋白免疫家兔以制备多克隆抗体,利用Western-blot和间接免疫荧光试验验证制备的家兔抗EDⅢ多克隆抗体与全病毒抗原的特异性反应,并通过噬斑减少中和试验(PRNT50)测定家兔抗EDⅢ多克隆抗体的中和抗体效价。结果表明,重组EDⅢ蛋白以包涵体的形式表达,并获得了较高纯度的EDⅢ重组蛋白,制备的家兔抗EDⅢ多克隆抗体与全病毒抗原具有良好的特异性反应,中和抗体效价为133±46.2。以上结果表明,基因Ⅰ型JEV GS株EDⅢ结构域具有良好的免疫原性,免疫动物所产生的抗体具有较高的中和抗体效价,EDⅢ结构域可作为JEV亚单位疫苗研制的候选抗原。     

免疫佐剂的作用机制及其应用

从抗原微粒化佐剂(如不溶性铝盐胶体、免疫刺激复合物、脂质体)、缓慢释放抗原佐剂(如油乳佐剂、抗原的微型包囊)、微生物佐剂(如细菌毒素、短小棒状杆菌菌苗、分枝杆菌及其成分、肽聚糖)、分子佐剂(如细胞因子、C3d分子、共刺激分子、超抗原、热休克蛋白、CpG序列)和其他佐剂(如维生素E、硒、抗生素类、拟胸腺素药物、蜂胶、中药多糖)等几方面阐述了免疫佐剂的性质、作用机制及应用的研究现状,为免疫佐剂的临床应用和进一步研制提供了参考资料。     

不同佐剂对猪圆环病毒2型灭活抗原免疫效果的影响

为了筛选到能有效提高猪圆环病毒2型(PCV2)灭活抗原免疫原性的佐剂,将ISA206、ISA15A、GEL、CP934、CP940五种佐剂与PCV2灭活抗原混合,配制疫苗后,进行小鼠免疫试验及猪体攻毒保护性试验。小鼠免疫试验结果显示,ISA206和ISA15A组的ELISA抗体、中和抗体水平和淋巴细胞转化试验刺激指数都显著高于空白对照组(P<0.05),但ISA206组与ISA15A之间无显著差异(P>0.05)。猪体攻毒保护试验结果显示,ISA206组的ELISA抗体水平、中和抗体水平明显高于其他组(包括ISA15A组)(P<0.01),二免后ISA206免疫组淋巴细胞转化试验刺激指数与ISA15A组之间差异不显著(P>0.05),但显著高于其他组(P<0.01)。攻毒后,ISA206组仔猪相对日增重高于其他各组(P<0.01),体内带毒和体外排毒的仔猪数量最少(各2头)、持续时间最短(分别在第11天和第7天消失)。病理切片显微观察显示,攻毒后ISA206组的组织病理变化最为轻微。上述结果说明,佐剂ISA206配制的疫苗免疫效果明显优于其他佐剂疫苗。     

ELISA抗体水平评价口蹄疫灭活疫苗免疫效果的可行性分析

为了探讨免疫抗体评价口蹄疫灭活疫苗效果的可行性,分别用5批次的口蹄疫O型-亚洲1型二价灭活疫苗(OS/99株+JSL/06株)、5批次的猪口蹄疫O型灭活疫苗(OZK/93株+OS/99株)免疫动物,在攻毒的同时采血分离血清,用液相阻断ELISA测定抗体效价,以分析抗体效价与免疫保护的关系。统计学分析表明,二价灭活疫苗的O型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.01),相关系数为0.986;亚洲1型免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间呈正相关关系(P<0.05),相关系数为0.997,猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫抗体值与攻毒保护率(概率单位)之间不呈正相关关系(P>0.05)。结果表明,应用抗体水平评价二价灭活疫苗的免疫效果是完全可行的,但用其评价猪O型灭活疫苗的免疫效果不具有可行性。     

DNA疫苗免疫佐剂的研究进展

简要阐述了细胞因子、共刺激分子、CpG DNA 和脂质体等 DNA 疫苗佐剂的来源、性质、免疫增强作用、作用机理和方式。认为以前的研究工作必然会使上述佐剂应用到 DNA疫苗的生产中。     

鸡传染性法氏囊病灭活疫苗免疫鸡中和抗体效价与攻毒保护力的相关关系

为了探讨鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护力的相关关系,以不同剂量的鸡新城疫、传染性法氏囊病二联灭活疫苗免疫21日龄的SPF鸡,免疫后采血测定鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体,并用传染性法氏囊病病毒强毒攻击,攻毒后第72小时,剖检所有试验鸡,观察鸡法氏囊等器官病变。将每只试验鸡的传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护情况进行一一对照。结果显示,当传染性法氏囊病病毒的中和抗体效价≥1∶16 384(214)时,可获得100%的保护;效价为1∶8 192(213)时,保护率为95.5%;效价为1∶4 096(212)时,保护率为92.9%;效价为1∶2 048(211)时,保护率为86.1%;效价为1∶1 024(210)时,保护率为76.5%;效价为1∶512(29)时,保护率为53.3%;效价为1∶256(28)时,保护率为33.3%,效价≤1∶128(27)时,保护率为0。试验证明,鸡传染性法氏囊病病毒中和抗体效价与攻毒保护力密切相关。     

猪圆环病毒2型血清中和抗体阻断ELISA检测方法的建立及应用

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法.用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应.该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验.用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%.另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%.表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重.     

甘肃犬瘟热病毒流行株N蛋白和H蛋白基因的序列分析

采用RT-PCR方法扩增了3株犬瘟热病毒(CDV)分离株的N、H蛋白基因,将其克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析。结果表明,获得的N蛋白基因序列与GenBank上登录的其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为92.5%～99.9%,获得的H蛋白基因与其他国家和地区的CDV分离株相应序列的同源性为81.7%～100%。由N蛋白基因和H蛋白基因推导的氨基酸序列构建的遗传进化树可知,这3株CDV流行株均处于野毒株的分支上,在N蛋白基因的遗传进化树上,CDV流行株呈现明显的地域性差异,而在H蛋白基因的遗传进化树上,不同国家和地区的CDV分离株之间虽有一定的地域联系,但与N蛋白基因相比,其地域性联系并不明显。说明这3株CDV流行株为野毒株,H蛋白基因的变异水平明显高于N蛋白基因,而N蛋白基因更能显示毒株与地域的关系。     

几种中药成分的免疫增强活性及其作用效果

测定了黄芪多糖等9种中药成分对正常小鼠脾和外周血淋巴细胞增殖反应的影响,并观察了这些中药成分对兔瘟组织灭活疫苗的增强免疫效果。结果表明,人参皂甙、黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖和蜂胶黄酮能显著增强伴刀豆球蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)诱导的小鼠淋巴细胞增殖,提高免疫兔抗体水平和延长抗体持续时间;板蓝根多糖能增强ConA和LPS的诱导活性,蜂胶多糖能促进ConA的诱导活性,黄芪皂甙和淫羊藿黄酮能促进LPS诱导的淋巴细胞增殖,但它们都不能提高兔瘟组织灭活疫苗的免疫抗体水平。     

口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及免疫原性检测

将口蹄疫病毒VP1基因克隆至原核表达载体 pBAD/TOPO中 ,经鉴定后得到了重组质粒 pBAD VP1。将此重组质粒转化到受体菌TOP10中 ,分别以不同浓度的诱导剂L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,并在不同诱导时间进行采样 ,经处理后做SDS PAGE和蛋白质印迹分析。结果 ,以终浓度为 0 .0 2 g/L的L 阿拉伯醛糖进行诱导 ,4h后表达可达到高峰 ,表达产物大小约为 4 0ku。软件扫描结果显示 ,VP1融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的 2 6 .3% ,能与抗FMDV抗体发生特异性反应 ,融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。抽提融合蛋白的包涵体 ,经过洗涤后制成油乳剂疫苗 ,经皮下注射免疫豚鼠 ,用乳鼠中和试验测定豚鼠血清中和指数 ,并用口蹄疫病毒对豚鼠进行攻毒。结果表明 ,用此融合蛋白的包涵体免疫豚鼠能诱导产生中和抗体 ,并对病毒的攻击提供免疫保护。     

金丝桃素可溶性粉体外抗犬瘟热病毒的试验研究

采用先药后毒、先毒后药和药毒同加3种不同的给药方式,分别在试验开始后第72 h和96 h观察犬瘟热病毒致Vero细胞的病变情况.结果显示,犬瘟热病毒的TCID_(50)为10~(-5.68)/0.1 mL,药物的TC_0为0.312 5 g/L;与对照组比较,药物浓度在0.039～0.312 5 g/L范围内先毒后药方式的细胞生长情况良好,细胞单层完整,视野中有极少量圆细胞或死细胞,而其余两种给药方式的细胞病变明显.结果表明,金丝桃素可溶性粉在先毒后药情况下可以有效抑制犬瘟热病毒的增殖.