马疱疹病毒1型gD基因主要中和抗原区在大肠埃希氏菌中的表达

利用PCR技术扩增马疱疹病毒1型(EHV-1)gD基因主要中和抗原编码区,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得的重组质粒pGEX-EHV-gD用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,重组gD蛋白以不溶性包涵体形式表达,与预期大小(43 ku)相符;Western-blotting分析表明,表达产物均能与抗EHV-1和EHV-4阳性血清发生反应。用重组蛋白免疫家兔获得的超免疫血清能中和EHV-1和EHV-4,且中和抗体效价较高,说明原核表达产物具有良好的免疫原性,可以用作ELISA包被抗原或重组基因疫苗。     

小反刍兽疫病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为开发可用于小反刍兽疫病毒(PPRV)诊断及其抗原的检测方法,参考GenBank中PPRV Nigeria75/1株N基因序列设计引物,采用RT-PCR方法获得目的基因后连接到载体pCzn1中,转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株,经PCR和双酶切鉴定测序后,将阳性克隆转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株后采用IPTG进行诱导表达。结果表明,成功地构建了含有小反刍兽疫病毒N基因的重组质粒pCzn1-N;诱导条件经过优化后N蛋白为可溶性表达,重组蛋白大小约为64 ku,能够与PPRV阳性血清较好地反应;制备的家兔多克隆抗体效价为1∶128 000,经过纯化后抗体效价为1∶64 000且具有较高的结合特异性;用间接ELISA和Western-blot对N蛋白纯化后制备的家兔多克隆抗体进行分析,发现重组N蛋白的免疫原性良好,且制备的多克隆抗体特异性良好。这表明重组的N蛋白具有较高的特异性及反应活性。     

猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。     

小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株F基因的克隆与原核表达

提取小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1的总RNA,用RT-PCR方法扩增F基因并克隆到pMD18-T载体中,以鉴定正确的质粒为模板克隆去掉N端信号肽和跨膜区的F基因(F-1)并亚克隆于原核表达载体pET-30a(+),得到重组质粒pET30-F-1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫SPF家兔制备抗体,进行间接免疫荧光检测并用ELISA测定抗体效价.结果显示,目的基因正确插入了表达载体,在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,用重组蛋白免疫3次后,兔血清抗体达到较高水平,Western-blot分析说明表达产物能够与兔血清抗体发生特异性反应,间接免疫荧光试验显示重组蛋白免疫兔阳性血清能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原.表明,重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达,并且具有较好的反应原性.     

鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备

以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60~110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,阳性质粒被命名为pET-32a(+)-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。     

非洲猪瘟病毒pNP419L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了评估原核表达的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pNP419L蛋白的免疫原性及其潜在的应用价值,将PCR扩增的NP419L基因片段插入载体pET-28a中,然后转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,以金属离子层析法纯化蛋白后,免疫新西兰大白兔制备家兔抗pNP419L多克隆抗体。结果显示,用PCR成功地扩增了NP419L基因序列,NP419L基因转入表达载体后被成功表达;纯化后的重组pNP419L蛋白的分子质量为42 ku;用间接ELISA检测家兔源多克隆抗体的效价达到1∶512 000,IFA试验及Western-blot检测表明该多克隆抗体具有良好的反应性及特异性。本研究为pNP419L蛋白生物学功能的研究奠定了基础。     

多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达

从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸.对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEx-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5a后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物.结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白.对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性.     

山羊痘病毒L1R蛋白的原核表达及其免疫原性的研究

为探究山羊痘病毒L1R蛋白的免疫原性,将山羊痘病毒的L1R基因克隆到p ET-30a(+)原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取阳性克隆进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot分析后进行纯化,将纯化的重组L1R蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、淋巴细胞增殖和微量中和试验研究重组L1R蛋白的免疫原性及其多克隆抗体的抗病毒作用。结果显示,成功表达出分子质量约为26 ku的目的蛋白,其可被山羊抗绵羊痘阳性血清所特异性识别。重组L1R蛋白能够刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫,并且其多克隆抗体能够中和山羊痘病毒,从而证实山羊痘病毒L1R蛋白具有良好的免疫原性。     

鸭肠炎病毒ul47基因的原核表达及其抗血清中和活性的鉴定

提取鸭肠炎病毒(DEV)基因组DNA,采用PCR方法扩增获得了DEVul47基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-30a-ul47,并转化受体菌Rosetta(DE3)pLysS中,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE分析。结果显示,ul47基因在大肠杆菌Rosetta中获得与预期大小相符的表达蛋白。利用Ni-NTA纯化表达蛋白,制备了兔抗DEV UL47蛋白的多克隆抗体,经琼脂双扩散测定,该抗血清效价为1∶16。间接免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验结果显示,DEV UL47蛋白主要定位于感染细胞的细胞质和细胞膜,制备的兔抗DEV UL47多克隆抗体对DEV有中和活性。     

鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区的原核表达及其表达产物免疫原性的研究

为了构建鹅细小病毒亚单位疫苗候选菌株,通过软件优化分析预测鹅细小病毒结构蛋白VP3的抗原表位分布,并设计抗原表位富集区的引物,PCR扩增获得目的片段,双酶切定向连接于pET-30a表达载体,转化BL21表达菌株诱导表达,获得目的蛋白,使用该蛋白免疫SPF鸡,制备抗血清,使用鹅胚成纤维细胞原代细胞进行中和效价的测定。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a-VP3,通过条件优化蛋白以可溶性形式存在,免疫制备的抗血清中和效价能够达到-2.608。结论:本研究以可溶性形式成功表达了鹅细小病毒结构蛋白VP3优势抗原表位区,且该蛋白作为免疫原具有很好的产生中和抗体的能力。     

帕利亚姆病毒VP7蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

本研究将帕利亚姆病毒(PALV)VP7蛋白的编码区序列插入原核表达质粒pET-32a(+),构建出重组质粒pET32-PALV-VP7,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行重组蛋白的诱导表达。采用镍离子亲和层析进行重组蛋白的纯化,通过透析进行纯化蛋白的复性,采用Western-blot对复性后的蛋白进行鉴定。将纯化后的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA、Western-blot与间接免疫荧光对多克隆抗体的效价与反应原性进行分析。结果显示,在37℃与0.1 mmol/L IPTG诱导条件下,PALVVP7重组蛋白在大肠杆菌中得以高效表达,其分子质量约为43 ku,以包涵体形式存在,占菌体蛋白总量的30.4%。重组蛋白经纯化与复性处理后纯度达94.1%,Western-blot结果显示,复性后的重组蛋白可与PALV阳性血清发生特异性结合。ELISA检测结果显示,制备的家兔抗PALVVP7多克隆抗体效价可达1∶12 000。使用该多克隆抗体为一抗,可通过免疫荧光与Western-blot检测到PALV感染细胞中的VP7蛋白,表明抗体可特异性结合PALV的VP7蛋白。本研究成功在大肠杆菌中表达PALV VP7重组蛋白,并制备获得多克隆抗体,为PALV诊断试剂的开发奠定了基础。     

猪生长激素基因的原核表达及其抗体制备

通过构建pGH基因的原核表达质粒,转化大肠埃希氏菌TOP10,经IPTG诱导,成功表达了重组猪生长激素的融合蛋白。经SDS PAGE分析,在分子质量50.4ku处有1条新的特异蛋白质条带。对以包涵体形式表达的融合蛋白进行SDS PAGE分离,并经透析得到了重组融合蛋白,以此融合蛋白免疫家兔,制备并纯化了抗pGH多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和免疫组织化学方法检测,此抗体具有较高效价和特异性。成功地表达了pGH基因并获得了多克隆抗体。     

猪细胞因子信号传导抑制因子1蛋白的表达纯化与多克隆抗体制备

为制备猪细胞因子信号传导抑制因子1(SOCS1)的多克隆抗体,采用RT-PCR扩增猪SOCS1基因序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET28a-pSOCS1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行表达,确定最佳表达条件,并对重组蛋白pSOCS1进行纯化。以表达的重组蛋白pSOCS1免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经4次免疫,间接ELISA测得抗体效价达到1∶51 200。Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明,该多克隆抗体可与pSOCS1重组蛋白和经HEK293T细胞过表达的pSOCS1蛋白发生特异性反应,证明pSOCS1重组蛋白免疫原性良好。本研究为后续制备单克隆抗体、研究猪SOCS1相关作用机制奠定了基础。     

结核分枝杆菌rv1738基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了在大肠杆菌中克隆表达结核分枝杆菌rv1738基因,并制备针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,以结核分枝杆菌H37Rv的基因组DNA为模板,PCR扩增rv1738基因,构建重组表达质粒pET-30a(+)-rv1738。重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,通过镍柱亲和纯化重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达情况,并用Western-bolt分析表达蛋白的反应原性。最后,以纯化的Rv1738蛋白免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-30a(+)-rv1738,经IPTG诱导在重组大肠杆菌中表达出分子质量为20ku的目的蛋白,并且以可溶的形式表达;对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白Rv1738能与家兔抗H37Rv多抗血清发生特异反应,具有良好的反应原性。纯化的Rv1738蛋白免疫小鼠后,能有效地刺激特异性抗体的产生,血清ELISA效价达到1∶8 800,且具有良好的特异性。以上结果表明,成功克隆表达了结核分枝杆菌rv1738基因,并制备了针对Rv1738蛋白的小鼠多克隆抗体,这一结果为探索Rv1738蛋白在结核病疫苗开发和新型诊断试剂研制方面的潜能奠定了基础。     

猪ISG15基因的克隆表达与多克隆抗体的制备

本研究从家猪外周血淋巴细胞中提取总RNA,通过RT-PCR克隆出家猪ISG 15基因,经测序和序列分析,将ISG 15片段与p ET28a质粒连接,构建重组原核表达载体p ET28a-ISG15;经IPTG诱导表达后,通过Ni柱纯化,以获得ISG15蛋白。用纯化的ISG15蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。结果显示,家猪ISG 15基因CD S区长504 bp,编码167个氨基酸,包括两个泛素样结构域(N端第3~75位和C端第81~156位氨基酸肽段)及C末端保守序列为LRLRGG;W estern-blot分析表明重组ISG15蛋白的免疫原性良好;经ELISA测定血清中抗体的效价为1∶102 400。上述研究结果为进一步揭示家猪ISG15蛋白的功能奠定了基础。     

口疮病毒VIR蛋白多克隆抗体的制备及VIR蛋白的亚细胞定位观察

为研究口疮病毒VIR蛋白的生物学特性,构建了含有VIR基因的重组表达质粒pET-VIR和含有绿色荧光蛋白融合真核重组质粒pEGFP-VIR;诱导表达和纯化VIR蛋白,并用纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定抗体效价,用Western-blot鉴定抗体的反应原性。利用脂质体介导法将pEGFP-VIR质粒转染绵羊睾丸细胞,4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核染色后激光扫描共聚焦显微镜观察VIR在细胞内的表达和亚细胞定位。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GSTVIR蛋白,主要以可溶性形式存在,其分子质量约27ku,制备的多克隆抗体效价达1∶218;Western-blot分析结果显示,此多克隆抗体有较好的特异性反应;VIR蛋白主要定位于细胞核内。本试验结果为VIR生物学功能的深入研究奠定了基础。     

多房棘球绦虫主要卵抗原重组蛋白的制备及其在免疫诊断中的初步应用

通过对多房棘球绦虫(Echinococcus multiloculais)主要卵抗原(Em MEA)基因的表达、抗体制备及血清ELISA检测,初步评价其作为诊断抗原的价值。根据WormBase数据库Em MEA基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增Em MEA基因并构建重组表达质粒,诱导表达、纯化重组蛋白Em MEA;制备Em MEA多克隆抗体并进行免疫组织定位;ELISA方法检测Em MEA重组抗原的敏感性和特异性。结果表明,Em MEA基因长度为957 bp,编码319个氨基酸,与其它绦虫中同源蛋白的氨基酸相似性为90.85%～96.93%。Em MEA重组蛋白约为40 ku,制备的多克隆抗体可识别虫体天然Em MEA蛋白,抗体效价达1∶25 600;Em MEA蛋白仅分布于原头蚴体壁。ELISA检测表明,Em MEA重组抗原和虫体天然抗原的特异性均为100%,Em MEA重组抗原的敏感性(100%)优于虫体天然抗原的敏感性(95.83%)。结合以上研究结果,Em MEA抗原具有作为多房棘球蚴病诊断抗原的潜能。     

可介导多药耐药的cfr基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为建立监测Cfr蛋白的方法奠定基础,采用PCR方法扩增cfr基因,并克隆入pEasy-T载体;测序确认后克隆入pET-28a(+)载体,构建重组质粒pET-28a-cfr,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并用IPTG诱导表达Cfr蛋白;用纯化的Cfr蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并对抗体进行鉴定。结果显示,成功克隆了全长cfr基因,构建了重组质粒pET-28a-cfr,并诱导了Cfr蛋白表达以及制备了小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体;Western-blot法鉴定该抗体可特异性识别重组蛋白Cfr;ELISA法测定抗体效价为1∶64 000。结果表明,用大肠杆菌BL21(DE3)能够成功表达Cfr蛋白,并且获得了高特异性、高效价的小鼠抗Cfr蛋白的多克隆抗体。     

鹦鹉热衣原体亚单位疫苗免疫原性及免疫保护性研究

本研究将鹦鹉热衣原体的MOMP基因经PCR扩增后与pET-22b(+)载体连接构建重组质粒,转化入E.coli,通过IPTG诱导表达MOMP蛋白,鉴定重组蛋白的表达和反应性。结果显示,重组蛋白被成功表达,分子质量大小为40 ku,经溶解、透析纯化后,重组MOMP蛋白纯度为91%,能与鼠抗重组MOMP蛋白抗体产生特异性反应,与鹦鹉热衣原体阳性血清呈强阳性反应。重组MOMP蛋白与ISA201佐剂乳化制成鹦鹉热衣原体亚单位疫苗,免疫绵羊后抗体效价高达1∶4 222,用强毒株攻毒后保护率达100%,表明此鹦鹉热衣原体亚单位疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护性。     

新城疫病毒M基因片段的表达纯化及其多克隆抗体的制备

M蛋白是新城疫病毒(NDV)的一个多功能结构蛋白。为了制备针对M蛋白的多克隆抗体,本研究通过克隆M蛋白部分基因片段至原核表达载体,重组蛋白在大肠杆菌中表达后进行了纯化。免疫新西兰大白兔获得血清并纯化后得到抗M蛋白多克隆抗体。Western-blot分析结果显示,该抗体具有良好的特异性。本试验成功制备的抗M蛋白多克隆抗体,为进一步研究M蛋白的生物学功能奠定了良好的基础。