布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株的建立及免疫特性测定

在建立了布氏杆菌单克隆抗体细胞株的基础上,筛选具有强保护作用的细胞株A_7免疫BALB/C鼠,进行细胞融合。用竟争抑制ELISA筛选出5个阳性孔。克隆化后首次建立了9个布氏杆菌单克隆抗独特型抗体细胞株。其中F9株经传25代后及液氮冻存复苏后仍能稳定地产生生高效价的抗独特型抗体。其Ig类型鉴定为IgG_(2a),并证实具有抗原“内影象”。以鼠RBC为载体将其吸附于RBC上进行小鼠免疫试验,检测结果表明该抗独特型抗体具有良好的免疫原性,能诱导免疫动物产生相当效价的抗布氏杆菌抗体(Ab_3)。     

牛型布氏杆菌苹果酸脱氢酶单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛型布氏杆菌(Brucella abortus)苹果酸脱氢酶(MDH)单克隆抗体,将牛型布氏杆菌A19菌株的MDH基因进行克隆和表达,表达产物被纯化后作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经亚克隆和间接ELISA筛选,最终获得3株分泌牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别被命名为C2、D5和F4。ELISA检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清的抗体效价为1∶1 600～1∶3 200,小鼠腹水效价为1∶12 800～1∶25 600;Western-blot检测结果表明,3株单克隆抗体均能与牛型布氏杆菌MDH重组蛋白发生特异性反应。结果表明,本研究成功制备了牛型布氏杆菌MDH蛋白单克隆抗体,为基于MDH的布氏杆菌检测方法的建立奠定了基础。     

基于牛源布氏杆菌重组膜蛋白的胶体金免疫层析试纸条的研制

为研制一种快速检测牛源布氏杆菌的免疫层析技术,本研究对牛布氏杆菌外膜蛋白omp22进行表达纯化,并用新西兰大白兔制备omp22多克隆抗体,将omp22蛋白作为胶体金标记物,家兔抗牛Ig G用于检测线,多抗用于质控线,制备了胶体金免疫层析检测抗体试纸条。结果显示,成功诱导表达大小为74 ku的可溶性重组蛋白omp22,且纯化后的重组蛋白omp22的浓度为2 mg/m L,纯度在85%以上;该胶体金试纸条在阳性血清稀释至1∶64时仍可见清晰条带;与牛结核、牛蓝舌病、牛病毒性腹泻、牛口蹄疫、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒比较,试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为94.2%(49/52),与牛羊布病抗体检测卡(KERNEL)的符合率为96%(49/50)。整个检测过程可在10 min内完成,肉眼即可判断。以上结果表明,该试纸条具有良好的重复性、敏感性和特异性,可适用于牛源血清中布氏杆菌病抗体的现场快速检测和筛选工作。     

用醛化红细胞分离抗禽流感病毒独特型多克隆抗体

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)抗体免疫家兔,制备抗独特型多克隆抗体;用戊二醛醛化的红细胞固定非特异性鸡抗体,再吸附兔抗鸡抗体,获得了纯的抗独特型抗体。经鉴定,该抗体既有弱的血凝性又有弱的血凝抑制性,并能与原病毒竞争性地和鸡抗AIV抗体结合。     

抗独特型抗体的应用

近年来,围绕免疫网络学说进行的研究异常活跃,研究结果不仅有重大的理论价值,而且在疾病预防和治疗上的意义也日趋明显。关于独特型的结构基础和免疫网络学说的论述很多,在此不再赘述,本文仅就抗独特型抗体的应用作一概述。 (一)抗独特型抗体代作疫苗 抗独特型抗体的疫苗样效应最初是在研究抗胰岛素抗体的过程中观察到的。现在已经知道,内映像抗独特型抗体(Ab_2β)具有模拟始动物抗原的作用,这就提示我     

抗弓形虫独特型抗体的研究——抗独特型抗体的制备及其免疫原性测试

用抗弓形虫单克隆杂交瘤细胞株(3C_2)扩大培养,于腹腔注射BALB/C小鼠诱生腹水,经3次饱和硫酸铵盐析,透析,DEAE-Sephadex-A_(50)离子交换层析,除菌,制得纯化McAb(Ab_1),蛋白含量2mg/ml,用福氏佐剂乳化后免疫健康家兔4次,放血分离血清,再经盐析和层析处理,制得多克隆抗弓形虫独特型抗体(Ab_2),用佐剂制备疫苗,3次免疫绵羊(5～10mg/只)2只。共采集4次血清,制得抗抗弓形虫独特型抗体(Ab_3),用IHA法检测抗体效价为1:64～1024。证实抗独特型抗体(Ab_2)是特异的,是能模拟弓形虫抗原,具有类似弓形虫免疫原性,并可激发宿主免疫应答产生抗体,进而证实独特型和抗独特型的免疫网络学说在弓形虫病免疫中的应用价值。     

兔源抗IBDV独特型抗体疫苗的制备

用纯化的抗鸡传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）抗体免疫家兔，将所获效价较高（１∶１６）的兔源抗ＩＢＤＶ独特型抗体分别与福氏完全和福氏不完全佐剂按１∶１比例乳化制备成抗ＩＢＤＶ独特型抗体疫苗。用该疫苗免疫迪卡公雏鸡和ＳＰＦ鸡，经用ＩＢＤＶ强毒株以点眼和滴鼻方式攻击，试验组的保护率分别为９８／９８，１００／１００，４９／４９，大群免疫接种的应答率为１００％。     

抗牛布氏杆菌单克隆抗体斑点酶联新方法的建立和应用

目前,诊断布氏杆菌病的传统方法很多,如平板凝集反应、试管凝集反应、补体结合试验、布氏杆菌全乳环状试验以及酶联免疫吸附试验方法等,这些方法各有不足之处。我们经过多次试验,首次建立了一种斑点酶联免疫与单克隆抗体相结合(McAbDot-ELISA)的新方法,并对100头健康牛和两个可疑奶牛场15份奶牛血清进行快速诊断,前4种方法均为阴性,后者查出17头抗体阳性牛,阳性率为14.78％,敏感性高于传统的试管凝集反应。符合率为84％;特异性优于平板凝集反应,符合率为77％。证明该方法具有特异、敏感、经济实用、便于推广等优点。     

牛蓝舌病病毒VP7抗体胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种快速检测牛蓝舌病病毒抗体的免疫层析方法,本研究通过胶体金标记蓝舌病病毒VP7蛋白,以兔抗牛IgG作为检测线,抗蓝舌病毒VP7蛋白单克隆抗体作为质控线,采用间接法制备了胶体金免疫层析试纸条。结果显示,该胶体金试纸条在蓝舌病病毒抗体阳性血清稀释度为1∶64时仍可检出;该试纸条与牛结核病、牛布鲁氏菌病、牛病毒性腹泻、牛巴氏杆菌病、牛地方流行性白血病的阳性血清均无交叉反应;与国外商品化试剂盒相比较,该试纸条检测结果与ELISA检测试剂盒(IDEXX)的符合率为92.7%(51/55)。结果表明,本试验初步建立的牛蓝舌病病毒抗体的胶体金免疫层析检测方法具有较好的特异性和稳定性,整个检测过程可在10 min内完成,能够快速检测样品血清,适用于现场快速检测。     

抗鼻疽菌核糖体单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1975年Kohler和Milstein创建的淋巴细胞杂交瘤技术,不仅是免疫学技术上的重大突破,而且在兽医学中得到广泛的应用。目前,兽医细菌学方面,国内外已成功地建立了抗布氏杆菌,炭疽杆菌,破伤风杆菌等细菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 我们在鼻疽免疫机理研究中,为了进行鼻疽菌抗原成分的分析,在建立了一株抗鼻疽菌朴反抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株的同时,还建立一株抗鼻疽菌核糖体单克隆抗体杂交瘤细胞株,经5次克隆化,半年的冻存和传代,能稳定地分泌高滴度的单克隆抗体。     

抗独特型抗体及其在疫病防治上的研究进展

自从1974年N.K.Jerne提出免疫网络学说以来,对于抗独特型抗体的研究日益增多,尤其是在感染性疾病的研究中,已显示出诱人的发展前景。Jerne认为,机体免疫系统内的各个细胞克隆,通过自我识别,相互刺激,或相互制约,构成一个动态平衡的网络结构。构成网络结构的物质基础,就是位于抗体分子上的独特型和抗独特型。Jerne因此在1984年获诺贝尔奖。 (一)抗独特型抗体的生物学基础 抗体是一类在抗原物质对机体刺激后所形成的、具有与该抗原发生特异结合反应的球蛋白。目前常把具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白,通称为免疫球蛋白(Ig)。Ig分子上有两种性质截然相反的部位,其     

牛布氏杆菌间接ELISA检测方法的建立

采用原核表达并纯化的布氏杆菌周质蛋白BP26作为包被抗原,建立了检测牛布氏杆菌血清抗体的间接ELISA(iELISA)方法。用建立的iELISA方法对138份临床奶牛血清样本进行了检测,并与虎红平板凝集试验(RBPT)和套式PCR(nested-PCR)进行了比较。结果表明,所建立的iELISA与RBPT和nes-ted-PCR的符合率分别为97.82%和98.55%。尽管该方法的敏感性略低于nested-PCR,但用iELISA检测病牛血清的阳性率可达93.00%。该iELISA方法可作为一种有效的牛布氏杆菌病血清学诊断的备用方法。     

抗独特型抗体Dot－ELISA检测实验感染绵羊和家兔日本血吸虫病

抗独特型抗体Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测实验感染绵羊和家兔日本血吸虫病田锷，林矫矫，叶萍（中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所２００２３２）Ｊｅｒｎｅ（１９７４）免疫网络学说的提出，为血吸虫病免疫机理的研究提供了新的理论依据。由于抗独特型抗体既可识别其特异...     

牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌双重PCR检测方法的建立

为快速检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌,根据GenBank中的布氏杆菌OMP31基因序列(JF918757)及副结核分枝杆菌ISMav2基因序列(AF286339)设计、合成2对特异性引物,通过对PCR条件的优化,建立了快速鉴别检测牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的双重PCR方法。经对建立的方法进行特异性和敏感性试验,结果表明,分别扩增出602、246bp的特异性牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌DNA目的条带,作为对照的双芽巴贝斯虫、大肠杆菌、沙门氏菌、弓形虫、链球菌、牛放线菌的DNA及其混合物均未扩增出任何条带。牛布氏杆菌与副结核分枝杆菌的最低检测限分别为1.92和2.51pg;牛肉样品中人工污染的牛布氏杆菌和副结核分枝杆菌的检测敏感性分别为6×104和7×104 CFU/mL。该双病原检测体系的成功建立为牛布氏杆菌病及副结核病的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持。     

布氏杆菌脂多糖的研究进展

布氏杆菌(Brucella)为革兰阴性胞内寄生球杆菌,可以感染牛、绵羊、山羊、猪、犬等哺乳动物和人,对畜牧业和人类健康危害严重。布氏杆菌脂多糖作为细胞膜的主要组成部分,是布氏杆菌最重要的表面抗原和刺激机体先天免疫的靶点,也是目前布氏杆菌致病分子机制研究和布氏杆菌病诊断、防控研究的热点之一。本文对布氏杆菌LPS的化学结构、生物合成及相关基因、脂多糖与机体天然免疫等方面的研究结果进行综述,以期阐释布氏杆菌的生存和致病机制,为布氏杆菌病的诊断和防控提供技术参考。     

猪瘟单克隆抗体诊断技术的推广应用

猪瘟是猪的烈性传染病，在我省时有暴发，对养猪业威胁很大，因此做好猪瘟诊断工作对预防和控制猪瘟的流行具有重要意义。猪瘟单克隆抗体诊断试剂由中国兽药监察所研制成功，并于１９９１年通过国家验收。该技术能识别猪瘟强毒抗体和猪瘟弱毒（疫苗）抗体，又能排除牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）和绵羊边界病病毒（ＢＤＶ）所产生的非特异性抗体。因此，它既可用于猪瘟免疫监测，又可用于猪瘟的诊断。我们在应用该技术进行猪瘟免疫监测的同时，用于现地猪瘟诊断，取得了良好的效果。１　材料与方法１．１　猪瘟单克隆抗体试剂　购自中国兽药…     

牛支原体脂蛋白P48单克隆抗体的制备及鉴定

为制备牛支原体表面脂蛋白P48的单克隆抗体,应用纯化的牛支原体武威株脂蛋白P48基因的原核表达产物免疫BALB/c小鼠,继而取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,经克隆和筛选,获得2株能分泌抗牛支原体脂蛋白P48抗体的杂交瘤细胞融合株,并分别命名为C7及E5。ELISA和W estern-blot检测结果表明,2株单克隆抗体均可与牛支原体特异性地结合,而与牛的其他常见病原菌无任何反应。亚类鉴定结果表明,2株单克隆抗体重链均为Ig G 1,轻链均为λ型。稳定性试验结果表明,2株杂交瘤细胞均可稳定分泌单克隆抗体。本研究结果为建立牛支原体有效的检测方法和深入研究脂蛋白P48的生物学功能奠定了基础。     

牛支原体P48蛋白的表达及间接血凝检测方法的建立与应用

优化并合成牛支原体的p48基因,将其克隆到pET-32a(+)表达载体上后,转化大肠杆菌BL21(DE3),16℃低温诱导表达,获得可溶性表达的大小约66ku的重组P48蛋白。将纯化后的重组P48蛋白致敏戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞,建立了检测牛支原体抗体的间接血凝试验。重组P48蛋白致敏红细胞的最佳质量浓度是20~40μg/mL,牛支原体超免疫血清抗体效价达1∶2 048~1∶4 096。该方法对牛肺疫、牛巴氏杆菌病、牛病毒性腹泻病、布氏杆菌病、结核病、口蹄疫、牛生殖道支原体感染、里奇氏支原体感染、大肠杆菌病阳性血清的检测结果均为阴性。该方法的特异性为100%,敏感性为93.33%。与国外商品化的牛支原体ELISA试剂盒相比,平均符合率为96.15%。对833份田间血清和1 084份乳清进行检测,阳性率分别是15.37%和19.56%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强和重复性好,可用于牛支原体抗体水平检测、牛支原体病的辅助诊断和流行病学调查。     

牛分枝杆菌PtpA基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为深入研究牛分枝杆菌PtpA基因在细胞免疫过程中所发挥的具体调控作用,本研究以牛分枝杆菌基因组为模板扩增得到PtpA基因,通过分子克隆的方法构建完成PtpA基因原核表达载体,并将表达载体质粒转入感受态细菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,在约35 ku处可见特异性蛋白条带。以抗组氨酸标签(HIS)单抗为一抗,对表达产物进行Western-blot检测,结果显示,表达产物可与抗HIS标签单克隆抗体发生特异性结合,证明该蛋白为所需的PtpA蛋白。通过免疫新西兰大白兔获得抗PtpA血清,所得血清用间接ELISA方法测得的血清抗体效价超过1∶1 000 000,具有较好的灵敏性。采用制备的PtpA多克隆抗体检测表达纯化的PtpA融合蛋白及真核表达的PtpA蛋白,结果可在约35 ku和约20 ku处产生特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。本研究为后续PtpA基因调控细胞免疫的具体机制的研究奠定了基础。     

口蹄疫超免疫血清的制备

超免疫血清 (ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｅｓｅｒｕｍ )是一种含有高效价特异性抗体的动物血清。口蹄疫 (ＦＭＤ)超免疫血清是采用口蹄疫病毒(ＦＭＤＶ)佐剂抗原作免疫原 ,通过逐次增大抗原含量多次免疫豚鼠 ,使豚鼠不断产生免疫应答 ,从而获得抗ＦＭＤＶ的高效价特异性抗体血清。该血清主要用于ＦＭＤ的中和试验、补体结合试验 ,也可用来生产诊断制剂 ,用于ＦＭＤＶ型的鉴定及易感动物的被动免疫。　　我们通过试验 ,以ＦＭＤＶ和弗氏不完全佐剂制备抗原结合物免疫豚鼠 ,定期采血 ,用补体结合试验监测抗体水平 ,使ＦＭＤ超免疫血清效价达到 1∶1…