猪白细胞介素-6基因在大肠杆菌中的表达及其产物的促淋巴细胞增殖活性

为研究猪白细胞介素-6(IL-6)作为免疫佐剂的可行性,用IPTG诱导含有猪IL-6基因的BL21(DE3)LysS工程菌,表达的目的蛋白经超声波破碎,洗涤,8mol/L尿素变性溶解后,用固化金属亲和层析法纯化后用谷胱甘肽再氧化还原法进行复性,并用MTT法对复性的重组蛋白的生物学活性进行分析.结果显示,复性的重组猪IL-6具有良好的刺激淋巴细胞体外增殖的活性.说明重组猪IL-6在作为免疫佐剂方面有一定的应用价值.     

大肠埃希氏菌表达FMDV 3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌 ,高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV 3AB非结构蛋白进行纯化 ,经SDS PAGE分析 ,3AB融合蛋白纯度达 90 %以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性 ,通过Westernblotting分析 ,表明复性后的 3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明 ,复性后的 3AB融合蛋白有很好的抗原活性。     

大肠埃希氏菌表达猪瘟病毒E2蛋白的纯化

采用 pPROEX HTB融合蛋白表达系统 ,将猪瘟病毒E2 基因与 6×His的编码序列在大肠埃希氏菌BL2 1(DE3)中进行融合表达 ,表达蛋白质主要以包涵体形式存在。用 8mol/L尿素溶解包涵体后 ,利用镍离子金属螯合亲和层析法纯化蛋白。结果 ,在SDS PAGE上显示出一 17ku的目的蛋白条带 ,纯度达到 90 %以上。纯化后的蛋白变性、复性处理后能与猪瘟阳性血清发生特异性结合     

猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立

旨在建立一种检测黏液中猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性SIgA的ELISA方法,从而评价PEDV黏膜免疫水平。首先将PEDV的S1D基因(534～789 aa)克隆至质粒载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,其表达产物以包涵体形式存在。Western-blot验证蛋白大小为32 ku,且具有抗原活性。再以8 mol/L尿素变性蛋白,经纯化、梯度复性后作为包被抗原蛋白,通过优化条件初步建立检测鼻腔和口腔黏液中PEDV特异性SIg A抗体的间接ELISA,并确定其最佳抗原包被浓度为2μg/m L;鼻腔黏液最佳稀释度为1∶1,最佳封闭液为50 g/L脱脂乳;口腔黏液最佳稀释度为1∶2,最佳封闭液为30 g/L BSA;酶标抗体最佳稀释度均为1∶2 000。最后应用该方法分别检测了84份已免疫猪的口腔、鼻腔黏液,其结果与以纯化的PEDV包被的间接ELISA相比,符合率达到95.2%。本研究中建立的检测黏液中PEDV特异性SIgA的方法简便快速,具有较好的敏感性、特异性,这为评价PEDV黏膜免疫水平提供了依据和检测标准。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP2-3-1的纯化复性与活性检测

收集含有口蹄疫病毒结构蛋白VP2 3 1基因的大肠埃希氏菌菌液 ,将其超声破壁 ,用菌体裂解液裂解 ,提取包涵体 ,并用 8mol/L尿素溶解 ,收集上清液 ,用亲和层析法纯化融合蛋白VP2 3 1 ,透析法复性 ,并用间接ELISA检测FMDV阳性血清和阴性血清。结果 ,P/N值大于 2 .1 ,说明纯化复性后的目的蛋白有一定的生物活性     

新城疫病毒F48E9株V基因的表达及其抗血清的制备

采用PCR方法从鸡源新城疫病毒(NDV)强毒F48E9株P基因重组质粒中扩增出了V 基因全长cDNA,并引进相应的突变位点,将其克隆到pMD18-T载体,然后亚克隆到原核表达载体 pET-30c上,重组质粒经酶切、PCR鉴定及测序,筛选出阳性重组质粒,并命名为pET-30c-V。将 pET-30c-V转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),用1 mmol／L IPTG 37℃过夜诱导表达,SDS-PAGE 及Western-blotting分析结果表明,所表达的NDV V重组蛋白主要以包涵体形式存在,分子质量约28 ku,与理论值大小相符。将包涵体用8 mol／L脲变性,经Ni-NTA柱纯化,透析复性,得到纯化的V蛋白。用复性后的V蛋白免疫21日龄SPF鸡(300 μg／只),成功制备了抗鸡NDV V蛋白的抗血清。     

水牛IFN-γ成熟蛋白基因的原核表达及其产物多克隆抗体的制备

将水牛γ-干扰素成熟蛋白(IFN-γ)基因亚克隆至pGEX-6P-1中,成功构建了pGEX-BoIFN-γ表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)重组菌进行IPTG诱导表达。应用SDS-PAGE方法对表达产物rGST-BoIFN-γ进行分析,用GST琼脂糖凝胶柱对可溶性蛋白进行分离纯化,并采用ELISA和Western-blot试验鉴定重组蛋白的免疫活性。将可溶性纯化蛋白作为抗原免疫小鼠,包涵体蛋白经SDS-PAGE分析后切取目的蛋白免疫小鼠以制备多克隆抗体。结果表明:重组菌经37℃0.5 mmol/L的IPTG诱导3 h,表达出43 ku的融合蛋白。目的蛋白的表达量达到菌体总蛋白量的30%,分别以可溶性和包涵体两种形式存在,而可溶性表达蛋白纯化后的纯度较高。获得的重组蛋白具有良好的免疫活性。均能从可溶性蛋白及包涵体蛋白免疫小鼠得到针对rGST-BoIFN-γ的特异性多克隆抗体。     

金黄色葡萄球菌336型多糖偶联抗原的制备及免疫原性

采用溶葡萄球菌酶消化菌体释放金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)336型多糖(Type 336polysaccharides,336PS),梯度乙醇浓度浸提和用不同酶消化进行粗提,通过凝胶过滤层析纯化得到了336PS多糖,并对其纯度进行检测。将336PS通过ADH间桥法与BSA连接制备偶联抗原,采用凝胶过滤层析纯化,200~400nm波长扫描鉴定,从层析波峰和检定波长判定偶联成功。加佐剂制备成疫苗免疫小鼠,进行抗体检测和小鼠免疫保护试验。结果表明,纯化的336PS纯度为685.1g/kg;偶联抗原波峰较BSA前移,其原最高吸收波峰为212nm,从206nm向280nm偏移。偶联抗原336PS-BSA可以刺激小鼠产生抗336PS的免疫应答反应,并能够对免疫小鼠提供免疫保护作用。     

番鸭呼肠孤病毒σNS蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备番鸭呼肠孤病毒(MDRV)YB株σNS蛋白的多克隆抗体,首先经RT-PCR扩增了σNS基因的完整编码序列,并成功构建了重组表达质粒pET-YB-σNS。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示成功高效表达出分子质量约为58ku的融合蛋白。该融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度、诱导温度分别为4h、1mmol/L和37℃。通过对包涵体和可溶性蛋白进行尿素洗涤纯化和(或)Ni 2+柱亲和层析纯化,得到了高纯度的重组蛋白。分别对纯化前、后的重组蛋白进行Western-blot分析,结果显示两者均可以与MDRV阳性血清发生特异性反应,表明它们具备良好的反应原性。将纯化后的可溶性σNS蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体ELISA效价达1∶32 000。上述研究结果为后续MDRVσNS蛋白功能研究奠定了基础。     

重组鸡IFN-α的高效表达与一步复性和纯化

通过在线网站以及生物学软件分析,将天然鸡IFN-α基因中的稀有密码子同义替换为大肠杆菌偏好的密码子.优化后的基因经人工合成后与温控型表达载体pWL连接并转入大肠杆菌中进行诱导表达,经SDS-PAGE分析,表达产物的分子质量约为19 ku,表达量占总蛋白的28.3%.表达产物主要以包涵体形式存在,用高浓度变性剂溶解后,采用Sephadex G50凝胶过滤一步复性并纯化重组鸡IFN-α,纯度可达98%以上.每1 L培养基可以得到47.1 mg的重组鸡IFN-α,产出率达34.14%.表达的重组鸡IFN-α在CEF/NDV检测系统上的比活性为1.12×10~8U/mg.