猪附红细胞体a1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体DnaK样蛋白HspA1编码基因a1的遗传变异规律,根据GenBank上登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列(登录号AM265536)设计合成1对引物,从上海市3个屠宰场采集自然感染猪附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA作为模板,进行a1基因部分序列的PCR扩增、克隆、序列测定及生物信息学分析。结果显示,共获得了41条猪附红细胞体a1基因片段序列,序列长度均为1 657bp;同源性分析显示,它们与GenBank中登录的猪附红细胞体a1基因核苷酸序列的相似性在97.7%~99.9%之间,氨基酸序列的相似性在99.1%~99.8%之间。系统进化分析表明,多数上海市猪附红细胞体分离株的a1基因与GenBank中登录的德国54/96分离株a1基因序列在同一个聚簇上。     

猪附红细胞体DnaJ基因的克隆及真核表达

为研究猪附红细胞体DnaJ基因的功能,根据GenBank中的猪附红细胞体全基因组序列（NC₀15153.1）,应用DNAStar、DNAMAN和ExPASy网络服务器筛选出1个候选蛋白基因DnaJ,设计合成1对特异性引物,经PCR技术扩增出DnaJ基因片段,克隆至pMD18-T载体上,并亚克隆到真核表达载体pVAX1上,构建了重组真核表达质粒pVAX-DnaJ,脂质体介导转染Vero细胞进行真核表达,RT-PCR和IFAT检测DnaJ基因在Vero细胞中的表达。结果表明,PCR扩增DnaJ基因的片段长度为876bp,编码292个氨基酸,与GenBank中的DnaJ基因同源性为99%;DnaJ基因在Vero细胞中获得瞬时表达。本试验为猪附红细胞体DnaJ基因的生物学特性及核酸疫苗的研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(Et SSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增Et SSADH基因序列,将扩增产物克隆入p GEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,Et SSADH基因的ORF序列长1 896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将Et SSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白的氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。Et SSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫SSADH基因的克隆原核表达与序列分析

为研究柔嫩艾美耳球虫琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)的生物学功能,参考已公布的柔嫩艾美耳球虫SSADH(EtSSADH)的基因序列设计特异性引物,运用RT-PCR方法扩增EtSSADH基因序列,将扩增产物克隆入pGEX-4T-1载体进行诱导表达。同时,利用在线软件对该基因编码蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,EtSSADH基因的ORF序列长1896 bp,编码631个氨基酸;该编码蛋白主要定位于线粒体,不含信号肽,无跨膜结构域;将EtSSADH与不同物种SSADH氨基酸序列进行比对,发现该蛋白氨基酸序列之间具有较强的保守性。诱导表达后获得分子质量约91.18 ku的重组蛋白。EtSSADH基因的成功克隆与表达为该酶的功能研究奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒新疆株NS基因的克隆和序列分析

根据已发表的H5N1禽流感病毒NS基因全序列设计了1对引物,对4株禽流感病毒新疆株的NS基因进行了RT-PCR扩增,并将其克隆到pMD 18-T载体上,分别获得了全长为817、851、8548、54 bp的全基因序列。序列分析结果表明,新疆毒株间的核苷酸同源性为97.8%~98.9%,氨基酸同源性为96.5%~98.7%,与广东、香港和东南亚等不同地区的11个毒株比较,同源性为90.0%~99.4%;与来自野禽、猪等不同种类的11个流感毒株比较,同源性为81.4%~99.3%。系统进化树分析表明,新疆株独立分支。     

鹅IL-18基因的克隆和原核表达及其多克隆抗体的制备

参考GenBank中鸡、火鸡和鸭IL-18基因序列,设计了1对特异引物,以提取的鹅脾细胞总RNA为模板,应用RT-PCR扩增、克隆鹅IL-18基因中间的333bp序列。序列分析结果表明,其与鸭IL-18基因对应序列相似性最高,达99%。参考鸭IL-18全基因序列设计上、下游引物各3条,以梯度PCR探索扩增、克隆鹅IL-18全基因。以上述策略成功扩增、克隆了3个广东地方杂交品种鹅的IL-18基因。序列分析表明,这3个杂交品种鹅的IL-18基因序列一致,长642bp,含一个603bp的ORF,编码200个氨基酸,分子质量为23.2ku。ORFN端的30个氨基酸为前导序列,其余170个氨基酸为功能蛋白序列。在GenBank中注册了第一条鹅的IL-18基因序列,登录号为EF159728。随后,构建了鹅IL-18基因ORF的重组原核表达质粒pET-GIL-18,经诱导表达、纯化获得重组鹅IL-18融合蛋白,并以其制备了兔抗重组鹅IL-18多克隆抗体。     

犬细小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大肠杆菌中的表达

从犬细小病毒病免疫预防失败病犬体内分离到1株犬细小病毒(CPV),命名为CPV-JS12株。病毒可凝集猪的红细胞,对乙醚不敏感,pH3不能灭活病毒,pH10可使病毒失去感染性,56℃作用60min病毒仍有活性,80℃作用30min可灭活病毒。序列分析时CPV-JS12为CPV-2a亚型,VP2基因全长1755nt,编码584aa,与国外CPV毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在98.9%~99.6%和98.3%~99.7%之间,与国内和周边地区毒株VP2基因的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分别在99.0%~99.7%和97.9%~99.7%之间;16个中国分离株处在不同组,CPV-JS12株与韩国毒株DH426处在同一分支上,亲缘关系较近。对CPV-JS12与免疫毒株VP2蛋白的立体结构分析比较,发现有9处氨基酸残基变异,其中6处位于衣壳蛋白表面,5处位于抗原表位区。将VP2基因在大肠杆菌中表达,重组VP2蛋白的分子质量为67.0ku,主要以包涵体的形式存在;Western-blot分析中重组VP2蛋白可与CPV阳性血清发生特异性反应。以纯化的重组VP2蛋白为抗原建立的CPV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

旋毛虫醛缩酶基因的克隆表达及重组蛋白酶比活性的分析

根据旋毛虫醛缩酶(aldolase,ALD)基因序列设计1对特异性引物,以肌幼虫总RNA为模板,通过RT-PCR扩增肌幼虫的ALD基因。将该基因克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,再将该基因亚克隆到pET-32a(+)载体中,测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后用SDS-PAGE进行分析。结果显示,该基因与GenBank中旋毛虫醛缩酶基因的相似性高达99%。该基因在大肠杆菌中获得了表达,表达的融合蛋白大小约为57ku,重组蛋白在菌体上清和沉淀中均有存在。Western-blot分析显示,重组蛋白可被人工感染旋毛虫的大鼠血清所识别。通过3-磷酸甘油醛脱氢酶偶联法测定该重组酶的比活性,发现该重组蛋白的最佳反应温度和pH值分别为35℃和7.0。结果表明,该重组蛋白具有一定的抗原性和酶比活性。     

麋鹿朊蛋白全基因的克隆及序列分析

为获得中国麋鹿朊蛋白(PRNP)的全基因,并利用DNAStar软件与已报道的其他动物的朊蛋白全基因序列进行同源性分析,根据GenBank中马鹿朊蛋白基因序列设计特异性引物,采用PCR方法从提取的总基因组中扩增得到麋鹿PRNP基因;将其连接到pGEM-T Easy载体中,获得克隆产物并测序。结果,成功扩增出了中国麋鹿PRNP基因,构建了重组质粒pGEM-T-ML;对克隆产物的序列分析表明,麋鹿PRNP基因的开放阅读框包含771bp,编码256个氨基酸的前体蛋白,前体蛋白的分子质量约为28 200u;与已报道的其他鹿科动物朊蛋白全基因的核苷酸及氨基酸序列的同源性均在98.8%以上,与几种非鹿科动物的同源性在96.5%～98.4%之间。结果表明,麋鹿PRNP基因的核苷酸和编码蛋白的氨基酸序列与其他鹿科动物的序列具有高度保守性,而与几种非鹿科动物间的同源性也较高,说明朊蛋白是一种古老的高度保守的蛋白。     

小附红细胞体的分离鉴定及其对猪的人工感染试验

采用2对附红细胞体种特异性引物,对上海地区2个屠宰场采集的736份猪血液基因组DNA进行PCR检测,将小附红细胞体特异性引物扩增产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定和生物信息学分析。将小附红细胞体阳性血液分离物肌肉注射给5头切除脾的断奶广西巴马小型猪仔猪,感染后定期采血,进行显微镜检,并提取基因组DNA进行PCR检测。另设3头猪作为不感染对照组,进行相同的检测。结果显示,共有101份样品检测出附红细胞体阳性,阳性率为13.72%,其中54份为小附红细胞体单独感染,占7.34%。5头巴马小型猪在接种小附红细胞体后第13~16天起,至第34天试验结束,出现明显的临床症状;血液显微镜检和PCR检测均发现存在小附红细胞体感染;其序列测定显示,16SrRNA基因的部分序列与接种的小附红细胞体的相应序列完全一致。上述结果表明,本研究成功筛选出小附红细胞体阳性血液,并成功实现了小附红细胞体对巴马小型猪的人工感染试验。     

猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因的克隆与序列分析

为了研究猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的结构特征及编码蛋白的功能,根据GeneDB中获得的2条cDNA序列设计引物,以猪囊尾蚴总RNA为模板进行RT-PCR,获得猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族(TsoStefin和TsoCystatin)基因的完整开放阅读框序列,并进行生物信息学分析。结果表明,所获得的2条序列均含有半胱氨酸蛋白酶抑制剂特征性的结构域。TsoStefin由98个氨基酸残基组成,不含二硫键和糖基化位点,为细胞内蛋白;TsoCystatin由274个氨基酸残基构成,含有1个糖基化位点和2个相似的结构域,第1~18位氨基酸残基组成信号肽,属分泌型蛋白。系统发育树显示,TsoStefin是半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族1的成员,TsoCystatin属家族2的成员,与部分绦虫的亲缘关系较近。从上述结果推测,所获得的2条基因均属于猪带绦虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族基因。     

牛带绦虫8ku蛋白基因家族cDNA的克隆和序列分析

根据带科绦虫8ku蛋白基因序列设计引物,采用RT-PCR方法对牛带绦虫六钩蚴总RNA进行扩增,扩增产物经胶回收试剂盒纯化,与pGEM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,筛选含有阳性重组DNA的克隆,对阳性克隆进行测序。使用DNAStar和MAGE 4生物学软件对基因克隆进行序列分析和进化树分析。结果显示,成功克隆了5种牛带绦虫8ku蛋白基因家族新成员,cDNA序列完整开放阅读框的大小为258bp,TSA8ku-1cDNA为优势克隆。序列同源性分析表明,各cDNA克隆氨基酸序列之间的差异性为1.2%～14.2%,与猪带绦虫诊断抗原TsRS1群(组)成员同源,相似性为85.9%～88.9%。由此可以推测,克隆的5种8ku蛋白基因家族成员可能是牛带绦虫病的重要诊断抗原候选基因。     

武威驴PrP基因序列与结构特征的分析

以武威驴朊蛋白(PrP)基因序列与结构特征分析为基础,通过比对找到奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因的差异,探究朊病毒病在奇蹄动物与偶蹄动物之间传播的种间屏障及其形成机制。分别从8头武威驴全血中提取基因组总DNA,用设计的特异性引物以聚合酶链反应扩增出细胞型朊蛋白基因(PrPC),并将其克隆到pGEM-T Easy载体。测序之后使用生物信息学方法与软件进行相关分析。序列测定分析表明,所克隆的武威驴PrP基因片段的大小为768bp,包含了驴PrP基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框。本次克隆的武威驴PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码九肽/八肽PQGGGGWGQ/PHGGGWGQ重复子。8个驴PrP基因之间核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别介于99.2%~99.8%和98.4%~100%之间。武威驴与西吉驴、马之间PrP基因序列的同源性分别为99.2%和98.7%,与牛、绵羊、马之间PrP基因C端约100个残基区域的三级结构的相似性分别为91.84%、92.04%和97.35%。结果表明,奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因存在明显的差异与进化分歧。     

非洲狮朊蛋白基因的克隆与序列分析

根据已报道的哺乳动物朊蛋白基因序列设计了1对引物,采用PCR方法扩增了16只非洲狮的朊蛋白基因,序列分析结果表明,所得到的非洲狮朊蛋白基因片段长678 bp、编码226个氨基酸的前体蛋白,其核苷酸序列的同源性为99.79%以上,发现了4个核苷酸多态性位点,无氨基酸变异。经与已报道的猫、貂、绵羊、牛、鼠和犬等哺乳动物的氨基酸序列进行比较,与猫(AF003087,96.7%)和绵羊(96.2%)的氨基酸同源性最高。     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

猪巨细胞病毒四川株gB基因的克隆表达及抗原性分析

为研究猪巨细胞病毒(PCMV)SC株gB蛋白的免疫学活性,采用PCR扩增PCMV SC株gB全基因和不含跨膜区及信号肽的gB基因片段,将后者克隆至pET-30a(+)载体,转化Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导以获得高效表达。将纯化蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,分别用琼脂扩散试验和Western-blot对多克隆抗体和复性的gB蛋白进行检测。结果显示,扩增的PCMV gB基因全长2 580bp,编码860个氨基酸。与国内外参考株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为97.8%～99.5%和96.6%～99.0%;与其他9株β疱疹病毒核苷酸和氨基酸序列相似性分别为33.3%～41.4%和13.3%～49.4%;系统进化分析显示,PCMV与人疱疹病毒6型和7型属于一个分支。gB肽链N端1～23位氨基酸为信号肽,729～751位氨基酸间含有跨膜区。构建的表达载体pET30a-gB-B在Rosetta(DE3)感受态细胞中经IPTG诱导后以包涵体形式表达出大小约80ku的蛋白。所制备的血清琼扩抗体效价为1∶16,Western-blot显示重组gB蛋白可与PCMV阳性猪血清反应。结果表明,PCMV gB基因较为保守,与国内外不同地区的PCMV毒株具有较高的相似性,所表达的重组蛋白具有很好的抗原性。     

猪热休克蛋白70基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中收录的猪HSP70基因序列,设计了1对特异性引物.运用RT-PCR技术从经热应激诱导的大约克猪组织总RNA中扩增得到了HSP70基因.并将其克隆至pMD18-T Simple载体上,进行序列测定.将编码猪HSP70的基因亚克隆至pET-32a(+)上,并将重组质粒pET-32-pHSP70在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中经IPTG诱导表达.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长2 200 bp,含1 932bp的开放阅读框,编码643个氨基酸,与已知猪HSP70核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达99.5%.SDS-PAGE电泳及Western-blot分析表明,猪HSP70在BL21(DE3)pLysS中得到了高效表达.     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了 1对PCR引物 ,以伪狂犬病病毒Ea株 (pseudorabiesvirusEa ,PRVEa)基因组DNA为模板 ,扩增出一大小为 5 11bp的片段。通过酶切和测序证实 ,该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因 ,即gL基因。Blast软件分析表明 ,该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为 94% ,氨基酸序列的同源性为 95 %。将测序结果输入GenBank ,获得登录号AF44 845 6。     

宁夏地区猪生殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及其变异分析

参考GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Jiangxi株和CH-la株的ORF5基因序列,设计并合成了1对引物,对宁夏回族自治区送检的18份PRRS阳性分离毒株进行RT-PCR扩增,获得约750 bp的DNA片段,将其分别克隆入pMD18-T栽体中,进行测序.应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332,BJ-4,RespPRRS MLV等毒株的ORF5序列进行比较,发现其核苷酸同源性为85.4%/～89.0%,与CH-la之间的核苷酸同源性为90.0%～98.2%,与欧洲代表株I,V的核苷酸同源性为55.9%～56.6%.基因系统进化树分析表明,发生于宁夏回族自治区的PRRSV属于美洲型,与CH-la遗传关系较近,归属同一基因亚型.     

猪生殖与呼吸综合征病毒宁夏分离株ORF5基因的克隆表达及其表达产物的活性分析

参考已发表的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因序列,设计合成了1对覆盖完整ORF5基因区段的引物,克隆了PRRSV NX/HY株的ORF5基因(登录号为EU600287),并进行了序列比较.将该基因克隆到原核表达栽体pGEX-6P-1中,构建了融合表达质粒pGEX-6P-1-5并转化BL21,对表达蛋白进行Western-blot分析.结果表明,NX/HY分离株ORF5基因与PRRSV JX1、CH-la株的核苷酸序列同源性分别为99.2%和95.2%,推导的氨基酸序列的同源性分别为98.5%和92.5%;层析扫描分析显示,目的蛋白的含量约占菌体总蛋白的30%,且具有良好的反应原性.GP5蛋白的表达为建立相应的血清学诊断方法奠定了基础.