肠出血性大肠杆菌O157∶H7 LAMP-LFD快速检测方法的建立及初步应用

针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)的rfbE基因保守序列设计特异引物,通过优化反应体系、反应温度和反应时间等参数,建立了一种快速、简便的肠出血性大肠杆菌O157∶H7的环介导等温扩增-横向流动试纸条(LAMP-LFD)检测方法。特异性试验结果显示,该方法与大肠杆菌O8∶K88和O141∶K99、无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌、产单核细胞李氏杆菌、表皮葡萄球菌、肠炎沙门菌、猪链球菌2型、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等12种细菌均无交叉反应。灵敏度试验结果表明,该方法对纯培养的EHEC O157∶H7的检测下限为13CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测下限为18CFU/mL。研究结果表明,该方法特异性好,灵敏度高,操作简便,可肉眼直接判定结果,1h内完成检测,在食品卫生检验和临床疾病诊断方面具有良好的应用前景。     

大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

以热灭活的大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)菌体抗原为免疫原,E.coli O157∶H7菌体结合脂多糖(LPS)为筛选抗原,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备E.coli O157∶H7LPS单克隆抗体。采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶(HRP)酶标抗体,并建立检测E.coli O157∶H7的双抗体夹心ELISA方法。结果,成功制备了9株稳定分泌E.coli O157∶H7LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞,其中7F9和7G2为LPS O-特异性多糖(O-SP)单克隆抗体,与E.coli O157∶H7菌体具有较好的反应性。此双抗体夹心ELISA方法对与受试的非O157菌株没有交叉反应,对E.coli O157∶H7纯培养菌液的检出下限为3×104CFU/mL。结果表明,建立的ELISA检测方法对E.coli O157具有较高的特异性和灵敏度,该方法有望与其他方法相结合用于对E.coli O157∶H7的检测。     

致狐狸眼炎大肠杆菌的生物学特性检测与致病性分析

为确定辽宁省某狐狸养殖场致患病狐狸眼炎的病原菌,从患病狐狸眼部分离病原菌,并对分离株进行形态观察、生化试验、16S rRNA基因序列测定、血清分型及进化分群,在此基础上完成了毒力基因检测、药敏试验以及人工感染小鼠试验等。镜检结果显示,该细菌为革兰阴性短杆菌,最终鉴定结果可以确定此分离株为O25型大肠杆菌,并且2株菌均属于系统发育群B2群。毒力基因检测结果显示,其含有CNF-Ⅰ基因,无LT、K99、STa、SLT-Ⅰ、CNF-Ⅱ及EAE等毒力基因。人工感染小鼠试验显示,2株分离菌株均可引起小鼠眼睛发炎,化脓等疾病,其对小鼠的半数致死量(LD50)分别为3.60×10~6CFU/只、1.79×10~6 CFU/只。药敏试验表明,其对庆大霉素、环丙沙星、黏菌素及氯霉素耐药性较强,但对头孢噻肟、磺胺甲恶唑、四环素、左氧氟沙星、氟苯尼考及大观霉素等抗生素较为敏感。本研究结果为临床治疗由大肠杆菌引起的狐狸眼炎提供了重要依据。     

动物性食品中大肠埃希氏菌O157∶H7特异性二重PCR检测方法的建立

根据大肠埃希氏菌O157∶H7wzx和fliC基因的保守序列设计了2对引物,建立并优化了特异性检测大肠埃希氏菌O157∶H7的二重PCR体系,扩增产物为395bp(wzx)和1057bp(fliC)。人工培养基中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限为2.3×102CFU/mL,人工污染的牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的检测下限分别为5.8×102CFU/mL、4.3×102CFU/g和3.1×103CFU/g。样品经3h预增菌后检测下限可达3.1×100~5.8×100CFU/mL(或CFU/g)。试验结果提示,针对wzx及fliC基因的二重PCR方法可以快速特异地检测出牛乳、猪肉及牛肉中大肠埃希氏菌O157∶H7的污染。     

猪源奇异变形杆菌的分离鉴定及其毒力的测定

为探究引起保育猪死亡的病原菌的生物学特性、耐药性及毒力,通过形态学观察、生理生化特性测定、16S rDNA基因序列分析、药敏试验、半数致死量测定对分离菌株进行鉴定。结果表明,分离菌株为奇异变形杆菌,16S rDNA基因进化树分析表明该分离菌株与来自印度海水中的分离菌株CIFRI P-TSB-13(JF784025)的亲缘关系最近;分离菌株对头孢西丁、头孢他啶、大观霉素、氨曲南这4种抗生素高度敏感,对米诺环素、呋喃妥因、阿米卡星等10种抗生素中度敏感,对庆大霉素、氧氟沙星、左氟沙星等21种抗生素不敏感,表明分离菌株具有多重耐药性。分离菌株感染斑马鱼的半数致死量为2.12×10~5CFU/mL,感染昆明小鼠的半数致死量为1.46×10~7CFU/mL。证实引起本次保育猪细菌感染的病原为奇异变形杆菌,且该分离菌株的毒力较强,建议治疗时应针对性地选择高敏抗菌药物。     

大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染牛和小鼠排菌检测中的应用

为了检验大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条在感染动物排菌中的应用效果,将牛和小鼠采用灌胃攻毒方式试验感染大肠杆菌O157∶H7,用大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法检测感染动物粪便中O157∶H7的排菌量和持续时间。牛在感染大肠杆菌O157∶H7后的第2天开始从粪便排菌,第4天达到峰值,排菌时间可持续28d;小鼠在感染O157∶H7后的第4小时开始从粪便排菌,第6小时达到峰值,排菌时间可持续15d。大肠杆菌O157∶H7胶体金免疫层析检测试纸条、细菌鉴别培养基培养计数以及PCR 3种方法的检测结果一致,但试纸条更简便、快捷、直观,1～5min可得出检测结果,便于现场检测样品中O157∶H7的快速筛查。     

山羊源志贺菌的分离鉴定及其部分生物学特性的研究

对采集自四川部分地区的226份羔羊粪便样本进行志贺菌的分离鉴定,同时对分离菌株进行血清型鉴定,并用PCR检测其携带sat、sen、set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A、ipa H共10个毒力基因的情况;采用灌胃法检测携带毒力基因最多的4株优势血清型菌株培养物对BALB/c小鼠的致病力。经细菌分离鉴定,从226份样本中共分离到54株志贺菌;血清型鉴定结果显示,4株的血清型为福氏志贺菌1a型,11株的血清型为福氏志贺菌1b型,28株的血清型为福氏志贺菌2b型,11株的血清型为福氏志贺菌3b型。54株志贺菌均携带sat、sen、ipa H基因,而set A、pic、sig A、ics P、ial、ics A、iut A基因的阳性携带率分别为73.6%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%,每个菌株携带4~10种毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b型优势血清型菌株均在1.7×108CFU/m L剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠的LD50为1.04×106CFU;致死小鼠的组织病理学检查显示,心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,提示结肠为该菌入侵的最有可能部位。本研究阐明了山羊源志贺菌的部分生物学特性,为山羊志贺菌病的防控提供了科学依据。     

猕猴肠侵袭型大肠杆菌的分离鉴定及其毒力因子基因的检测

2010年5月从四川省某猕猴养殖场急性腹泻猕猴肠道内分离出4株致病性大肠杆菌,并对其进行了16SrDNA扩增、生化反应、血清型鉴定、药敏试验以及毒力因子基因的分子生物学检测。结果显示,该菌株血清型为O28;药敏试验证实该菌对多种抗生素具有抗性,并且呈现多重耐药性;攻毒试验证实该菌能够导致小白鼠大量死亡;多重PCR成功检测出侵袭性大肠杆菌的Einv毒力基因。确定该病原菌为肠侵袭型大肠杆菌,而且毒力很强。     

猪链球菌2型和9型广东分离株的病原特性

2005年夏秋季从广东地区9例病猪中分离到2株猪源链球菌,均呈链球菌的特征形态,α溶血,生化试验结果相似,且都不与A~G链球菌群特异性血清发生凝集。经PCR及测序鉴定,一株为猪链球菌2型,另一株为猪链球菌9型。2型分离株的3个毒力基因均为阳性(sly+epf+mrp+),但对小鼠的毒力较低,2/10小鼠在接种细菌后第6~15 d发病致死,细菌在小鼠中的带菌时间至少15 d;9型分离株3个毒力因子均阴性(sly-epf-mrp-),但对小鼠有较强毒力,9/10小鼠在接种细菌后5 d内发病死亡,对小鼠的半数致死量为1.70×106CFU。表明广东地区致病性猪链球菌不仅存在2型,而且还有9型。     

牛源A型多杀性巴氏杆菌的生物学特性鉴定与致病基因检测

为研究在田间分离的1株牛源多杀性巴氏杆菌的生物学特性及致病特征,对该菌用平板划线法进行纯化;并利用文献中所提及的该菌分型引物及常见毒力基因引物对其血清型及毒力基因进行PCR检测;利用该菌进行动物致病力回归试验,以石蜡切片的形式观察病理变化;并对其具有较强致病性的原因进行分析。结果显示,该菌株为A型多杀性巴氏杆菌;该菌的半数致死量为25.85 CFU/m L,为强毒株;耐药性无明显变化;23种常见毒力基因中检测到19种。动物回归试验观察结果显示,小鼠出现呼吸急促,精神沉郁,畏寒,眼内出现分泌物等临床症状;病变器官组织学观察结果显示,其主要病变为肺泡充血、炎性渗出,脾淋巴细胞减少及巨噬细胞增多,肝细胞及肾小管上皮细胞广泛性坏死等病变。结果表明,该菌具有较强的毒力,病症久治不愈的原因与毒力因子的分布有关。     

猪链球菌9型国内分离株毒力基因的检测及小鼠免疫试验

通过检测7株猪链球菌9型(SS9)国内分离株的毒力基因,比对7株SS9荚膜合成基因cps9j的300 bp碱基序列,以及进行7株SS9对小鼠的毒力试验和免疫保护试验,初步探讨了国内SS9的毒力特性.结果显示,7株SS9均缺失胞外因子(epf)和溶血素(sly)基因,溶茵酶释放蛋白基因(mrp)存在于GZ0665和GD0606株,orf2仅存于GZ0665株;病猪脑脊液分离株GZ0665与从健康猪扁桃体分离的6株SS9的cps9j同源性低;在7株SS9分离株和SS2分离株HA9801中,只有GZ0665和GD0606株能致死小鼠;用灭活的GZ0665菌株免疫的小鼠对同源菌株GZ0665及GD0606株攻击的保护率均为100%(10/10),用灭活的GD0606和未灭活的GD0627菌株免疫的小鼠对GD0606株攻击的保护率分别为80%(8/10)和50%(5/10),而对GZ0665株攻击的保护率分别为60%(6/10)和30%(3/10).证实,SS9病猪脑脊液分离株的毒力基因有剐于SS9健康猪扁桃体分离株和SS2.表明,小鼠可以用来区分SS9病猪脑脊液分离株与健康猪扁桃体分离株的致病力.     

牛源B型产气荚膜梭菌的分离鉴定与毒力基因检测

为探究内蒙古通辽市某牛场牛猝死的原因,本研究采集病死牛肠道内容物,分别进行革兰染色镜检、全自动微生物分析系统检测、16S rRNA基因扩增、毒力基因检测及系统进化树分析、动物致病性试验、半数致死量试验。结果显示,分离菌形态、生化特性符合产气荚膜梭菌的特性;16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的产气荚膜梭菌的同源性为99%,系统进化树分析该分离菌与B型产气荚膜梭菌的亲缘性最近;3种毒力基因在该致病菌中均被检测到;分离菌对小鼠有致死性;该菌对小鼠半数致死的浓度为2.27×10~7CFU/mL;药敏结果显示,分离菌株对多黏菌素、庆大霉素等药物敏感,对卡那霉素等药物中度敏感,对头孢他啶、阿莫西林等药物耐药。该致病菌经鉴定,确定为B型产气荚膜梭菌,毒力基因分别为α、β_2和ε毒素。     

天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×106CFU/m L,最大值为5.7×108CFU/m L;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、 fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、 37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×103～3.9×104CFU/m L,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。     

禽致病性大肠杆菌强毒力岛摄铁功能与致病性关系的研究

采用PCR法检测强毒力岛主要结构基因irp1、irp2、fyuA在禽致病性大肠杆菌中的分布;铬苯胺醇法检测铁载体的合成;SDS-PAGE法检测耶尔森菌摄铁蛋白HMWP1和HMWP2的表达,以半数致死量试验测定禽致病性大肠杆菌致病性与强毒力岛摄铁功能的关系。结果表明,7株禽致病性大肠杆菌强毒力岛irp1、irp2和fyuA基因的检出率为100%;铬苯胺醇平板上都能产生橙色透明晕圈;缺铁条件下,能够表达与耶尔森菌相同的摄铁蛋白HMWP1和HMWP2且半数致死量试验验证禽致病性大肠杆菌的毒力与强毒力岛摄铁功能呈正相关。证实禽致病性大肠杆菌中强毒力岛的摄铁功能与其致病性有密切的联系。     

貂源铜绿假单孢菌的分离鉴定及其致病性研究

为确定山东威海某养殖场发病水貂的病原菌,从发病水貂肺中分离并纯化细菌,根据其形态特征、培养特性、生化试验结果及PCR鉴定,确定其为铜绿假单孢菌。致病性试验中,将8.0×1010CFU/mL的菌液10倍系列稀释后,感染60日龄健康昆明系小鼠,半数致死量和最小致死量分别为1.4×107 CFU/mL和8.0×106 CFU/mL。剖检死亡小鼠可见皮下和肺出血,并能从死亡小鼠的肺中分离出与感染菌株形态特征完全一致的菌落。药敏试验结果显示,该分离菌株对庆大霉素、环丙沙星、诺氟沙星、头孢哌酮等较为敏感,而对青霉素、链霉素不敏感。系统发育分析结果表明,该分离菌株与从小麦中分离的铜绿假单孢菌的亲缘关系最近,据此怀疑该发病水貂有可能是食用了污染的饲料引起的。     

鸵鸟新城疫病毒的分离及毒力测定

从贵州省某鸵鸟饲养场病死鸵鸟的脑、脾中分离出 1株新城疫病毒———鸵鸟ND99,结合发病情况、临床症状、病理剖检确诊该场流行的以急性死亡为特征的传染病为鸵鸟新城疫。经最小致死量致死鸡胚的平均死亡时间 (MDT)、3日龄雏鸡脑内接种指数 (ICPI)、6周龄鸡静脉接种指数 (IVPI)测定 ,表明该分离株为缓发型毒株 ,其毒力弱于LaSota株。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊,无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定,对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果,该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌;药敏试验表明,分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感,对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感,对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药;耐药基因检测显示,该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因;动物试验表明,接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡,接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡,死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明,该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株,是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

竹鼠源绿色气球菌和大肠杆菌的分离鉴定及致病分析

从贵州省某竹鼠养殖场送检的6只患病竹鼠的不同组织病料中分别分离到两种不同的细菌,经细菌形态观察、生化试验鉴定、16S rDNA基因序列分析,确定两株分离菌一株为大肠杆菌,命名为GZ-QDN1;另一菌株为绿色气球菌,命名为GZ-QDN2。药敏试验结果显示,分离菌株GZ-QDN1对头孢曲松、头孢拉啶、复方新诺明等9种药物有较强的敏感性,分离菌株GZ-QDN2对恩诺沙星、多黏菌素B、新霉素等10种药物有较强的敏感性。动物回归试验结果显示,分离菌GZ-QDN1和GZ-QDN2具有较强的致病性,对竹鼠的半数致死量LD50分别为1.45×106CFU/m L和1.75×106CFU/m L。组织病理学观察显示,死亡竹鼠心脏、肾和肺等发生了细胞排列较疏松、出血、粒细胞浸润等病理变化。本研究从竹鼠体内分离到致病性大肠杆菌和绿色气球菌各1株,为该竹鼠养殖场查明了主要病因并为细菌性疫病的防治提供了用药参考。     

鸡源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性分析

为了对云南某鸡场发生鸡急性死亡的疑似禽霍乱病例进行病原确诊。无菌采集送检死鸡肝脏组织进行细菌分离培养、生化鉴定、细菌16S rRNA基因分析及荚膜分型鉴定，对分离菌株进行耐药性、致病性分析。结果，该分离菌为荚膜A型多杀性巴氏杆菌；药敏试验表明，分离菌对头孢氨苄、头孢他啶、阿莫西林、氨苄西林等8种药物敏感，对大观霉素、复方新诺明等6种药物中度敏感，对卡那霉素、链霉素、四环素等12种药物耐药；耐药基因检测显示，该分离株仅含有磺胺类sul2基因和四环素类tetB基因；动物试验表明，接种500 CFU的45日龄鸡在接种后7 d内全部死亡，接种12.5 CFU的小鼠在接种后48 h内全部死亡，死亡小鼠病理组织切片显示各器官均有不同程度的病变。上述结果表明，该分离株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌强毒株，是该鸡场发生疫情的病原。本研究结果为我国鸡源多杀性巴氏杆菌的遗传特性研究提供了基础资料。     

大肠杆菌O157及其Stx2免疫胶体金层析检测方法的建立

建立了大肠杆菌O157和志贺毒素2(Stx2)的双抗体夹心免疫胶体金层析法,并运用该方法对上海市兽医生物技术重点实验室保存的已鉴定的58株大肠杆菌进行了检测,评估了其特异性、敏感性和重复性.结果显示,大肠杆菌O157层析法的敏感性为1×105CFU/mL,特异性为87.5%,批间和批内变异系数分别为8.6%和0;Stx2层析法的检测下限为200μL细菌培养液,特异性为50.0%,批间和批内变异系数分别为50.0%和33.0%.表明,该免疫胶体金层析法能快速、简便、特异地检测大肠杆菌O157;结合对Stx2的检测,能快速检出产Stx2的大肠杆菌O157菌株.