猪瘟病毒石门株E2蛋白的单抗制备及抗原表位鉴定

用猪瘟病毒石门株E2(SM-E2)的BC区原核表达蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术制备单抗,测定其效价并鉴定抗原表位。结果表明,制备了1株持续、稳定分泌抗SM-E2的单克隆抗体2B10,效价在1∶600～1∶1 000之间。单抗2B10能与常规SDS-PAGE转膜的SM-E2蛋白发生反应,表明其识别的是线性表位,并且该单抗只能识别石门毒株,而不能与C株疫苗及2型流行毒株发生反应。点突变E2蛋白ELISA分析结果表明,该单抗不与707、709、711、713和714位突变蛋白发生反应,表明单抗2B10识别的线性表位为707I-X-P-X-G-X-G-G714。该单抗对猪瘟病毒抗原多样性分析和致病机制研究有一定的应用价值。     

猪瘟病毒野毒株E2蛋白特异性单抗免疫抑制制备法的建立

采用环磷酰胺免疫抑制法制备特异性识别猪瘟病毒(CSFV)野毒株的单克隆抗体,用纯化的杆状病毒表达的重组HCLV-E2蛋白作为耐受原,Shimen-E2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,获得了1株能稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,结果显示该单克隆抗体能够与CSFV石门株发生反应,同时能与1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群CSFV野毒发生特异性反应,并具有中和活性,而与CSFV兔化弱毒疫苗株不发生反应.表明,该单克隆抗体可以用于鉴别CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株.     

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针,建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来,而不与其他猪源病毒发生非特异反应,分别可检测到初始模板中41.8和81.5个拷贝的病毒RNA,与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近,两种方法对152份样品检测的符合率达96.9%~100%。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测,证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性,可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的 2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测 2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门 (Shimen)株进行了比较分析。结果显示 ,GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为 82 .1%和 82 .6 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 87.9%和 88.7% ;GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为 83.6 %和 84 .0 % ,推导氨基酸序列的同源性分别为 89.3%和 90 .1%。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区编码基因的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用RT-PCR扩增了猪瘟病毒(CSFV)兔化弱毒疫苗株(C株)的E2蛋白主要抗原区(tE2)编码区,并定向克隆到表达载体pPROEX-HTb中,获得重组表达载体pPROEX-tE2,将其转化大肠杆菌DH5α菌株,经IPTG诱导,tE2蛋白获得高效表达;经检测,该重组蛋白能被CSFV C株抗血清识别.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,获得了1株稳定分泌抗tE2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株.经检测,该单克隆抗体能够与CSFV C株和石门株以及杆状病毒表达的重组E2蛋白发生特异性反应.推测,该单克隆抗体是针对CSFV E2蛋白的一个保守线性表位.     

猪瘟病毒遗传发生关系分析

利用反转录（ＲＴ）及ＰＣＲ扩增并测定了中国猪瘟兔化弱毒（Ｃ－株）兔组织毒、Ｃ－株细胞疫苗毒和近期（１９９７～１９９８年）甘肃省７个地区的１０个流行野毒株的Ｅ２基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：Ｃ－株兔组织毒、Ｃ－株细胞毒和中国５０～６０年代流行的石门强毒株同属于组群１（Ｇｒｏｕｐ１）;近期猪瘟流行毒株同属于组群２（Ｇｒｏｕｐ２）的两个不同的亚组群（Ｓｕｂｇｒｏｕｐ２．１和２．２）,其流行毒株与疫苗毒株有较大的差异（Ｅ２全基因核苷酸序列同源性８２．２％～８４．３％）,表明猪瘟流行毒株向远离疫苗毒株的方向演变。     

猪瘟病毒NS3蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

以含有猪瘟病毒(CSFV)石门株全长cDNA的重组质粒pOKShimen为模板,经PCR扩增获得NS3基因,利用原核表达载体pMAL-c2X、pET32a以及杆状病毒表达载体pFastBacH T B表达CSFV石门株NS3基因,获得3种重组蛋白:MBP-NS3、His-NS3和rNS3。Western-blot分析及间接免疫荧光试验证实,这3种不同载体表达的NS3蛋白均能被猪瘟阳性血清所识别。利用直链淀粉树脂柱对重组蛋白MBP-NS3进行纯化后,用其免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,用间接ELISA筛选,获得2株能稳定传代并分泌针对抗CSFVNS3蛋白单克隆抗体的细胞株,命名为1D10和1H10。Western-blot分析及间接免疫荧光试验结果证明,这2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体均可识别CSFVNS3蛋白。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1亚区抗原性分析

采用Bac to Bac杆状病毒表达系统 ,对猪瘟病毒A抗原区内的 2 74 4～ 2 94 7nt基因片段(EC)进行了克隆、表达 ,并分析了表达产物的抗原性。研究发现 ,EC表达产物能与抗猪瘟病毒Al fort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2 4 10、a18发生特异性结合 ,且用其免疫动物后能诱导机体产生中和抗体。结果表明 ,A1抗原亚区位于E2蛋白 791～ 85 8位氨基酸区域。     

广西猪瘟流行现状的调查分析

据对广西 13个发病猪场 (疫点 )猪瘟 (CSF)的流行病学调查分析 ,发现当地CSF流行以非典型为主 ,典型CSF同时存在 ,发病猪多在 3月龄以下且病程较长。母猪存在隐性感染 ,部分表现为繁殖障碍 ,一些临床健康猪存在着带毒问题。此外 ,从疑似CSF病料中扩增出牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) ,表明广西猪群中存在着BVDV的感染。分子流行病学调查结果表明 ,猪瘟病毒 (CSFV )广西流行株的基因型较复杂 ,分布 2个基因群的 4个亚群 ,其亲缘关系与 2个传统毒株石门株 (Shimen)和兔化弱毒株 (HCLV)相距甚远 ,最高可达 2 0 .0 %,说明广西CSFV流行株存在着遗传多样性。     

猪瘟的分子生物学诊断

采用RT PCR方法 ,从经临床和血清学初步诊断为猪瘟的病料中扩增了猪瘟病毒 (CSFV)的E2基因某一片段 ;对扩增片段进行序列测定 ,通过DNAsis软件构建了系统发生树 ,确定了这一流行株 (IPI株 )在系统发生树中的位置。结果表明 ,从IPI株和石门株 (Shimen)中均扩增出 2 71bp目标片段 ,这一流行株与我国 2 0世纪 90年代以来流行的绝大多数CSFV毒株同属于基因 2群中的 2 .1基因亚群 ,与YN1、YN2、GX4、GZ1的关系较近 ,而与Shimen株、兔化弱毒株 (HCLV)等我国传统的标准毒株相距较远。这一结果为猪瘟的诊断和检疫提供了一种特异、可靠的方法