猪瘟的分子生物学诊断

采用RT PCR方法 ,从经临床和血清学初步诊断为猪瘟的病料中扩增了猪瘟病毒 (CSFV)的E2基因某一片段 ;对扩增片段进行序列测定 ,通过DNAsis软件构建了系统发生树 ,确定了这一流行株 (IPI株 )在系统发生树中的位置。结果表明 ,从IPI株和石门株 (Shimen)中均扩增出 2 71bp目标片段 ,这一流行株与我国 2 0世纪 90年代以来流行的绝大多数CSFV毒株同属于基因 2群中的 2 .1基因亚群 ,与YN1、YN2、GX4、GZ1的关系较近 ,而与Shimen株、兔化弱毒株 (HCLV)等我国传统的标准毒株相距较远。这一结果为猪瘟的诊断和检疫提供了一种特异、可靠的方法     

瘟病毒非结构蛋白的结构和功能

猪瘟病毒 (CSFV)、牛病毒性腹泻病毒 (BVDV )和边界病病毒 (BDV)均为黄病毒科 (Flaviviridae)瘟病毒属 (Pestivirus)的成员[1] 。它们在结构、抗原性和遗传上关系密切。据推测CSFV、BVDV和BDV是由一个共同的祖先为适应不同动物演变而来。BVDV和BDV可感染反刍动物和猪 ,CSFV仅感染猪。瘟病毒属成员均为小的、有囊膜的、单股正链RNA病毒。病毒基因组长约 12 .312 .5kb。CSFV基因组为单股正链RNA ,长约 12 .3kb ,包括一个 5′非翻译区 (5′UTR) ,一个编码 4种结构蛋白 (C、Erns、E1和E2 )和 8种非结构蛋白 (Npro、p7、NS…     

猪血清中牛病毒性腹泻病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体的ELISA方法,经ELISA反应条件优化、特异性试验、重复性试验及与中和法、IDEXX ELISA对比试验建立了特异性ELISA。用此方法对福州市周边20个猪场的222份猪血样进行了BVDV抗体检测。结果显示,本ELISA反应条件为:BVDV Oregon C24V与NADL株联合包被(质量浓度均为31.25μg/L,每孔加50μL)的条件为37℃1h加4℃8h,家兔抗猪瘟病毒(CSFV)超免疫血清(每孔血清效价可中和400RID CSFV)阻断时间为2.0h,封闭剂和血清稀释液中NaCl的浓度和Tween-20的体积分数分别为0.7mol/L和3.00mL/L,100mL/L马血清封闭剂、1∶50稀释的待检血清、0.625 mg/L HRP-家兔抗猪IgG酶标二抗(100μL/孔)及底物的反应时间分别为2.0、0.5、0.5h及15min;检测CSFV、伪犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性;4份血样进行5次板内、板间重复试验结果均一致;参照中和试验,本ELISA方法的符合率(97.9%)高于IDEXX BVDV ELISA抗体检测试剂盒(93.8%);福州市周边猪群BVDV抗体阳性率为34.7%,猪场阳性率为80.0%,其中母猪群阳性率(44.6%)高于商品猪群(26.4%)。结果表明,本ELISA方法特异性强、符合率高、重复性好,适合用于猪源BVDV的血清学监测。     

猪瘟野毒E2基因同源性比较

以人工感染发病猪的脾为材料提取总RNA ,根据已报道的猪瘟病毒基因组序列 ,设计合成了 2对引物 ,以总RNA为模板 ,利用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)、套组聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术 ,对流行于我国甘肃省、陕西省、宁夏和广西自治区的 5株野毒株的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定 ,用DNAstar软件比较分析了 5株野毒之间及其与猪瘟兔化弱毒株 (C ST株 )E2基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。结果发现 ,5株野毒与C ST株核苷酸序列的同源性为 81.7%～ 83.1% ,氨基酸同源性为 87.3%～ 88.6 % ,表明它们之间存在较大的差异 ;但 5株野毒之间核苷酸序列的同源性高达 98.8%～ 99.3% ,氨基酸同源性为96 .6 %～ 99.2 % ,表明它们之间的差异较小     

猪瘟兔化弱毒疫苗RT-LAMP检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪瘟病毒(CSFV)野毒株、猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的NS5B基因序列,利用在线软件Pri mer Explorer V4Software,设计了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP)引物,建立了特异性检测HCLV的RT-LAMP方法。在BstDNA聚合酶作用下,65℃恒温反应1h即可完成扩增过程,扩增产物可通过20g/L琼脂糖凝胶电泳或加入SYBR GreenⅠ染料进行分析。经检测,该方法对于CSFV、BVDV以及其他猪源病毒无特异性扩增,具有良好的HCLV特异性;其灵敏度与本实验室建立的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测结果一致,均达到5个拷贝。分别用这两种方法对58份市售猪瘟弱毒疫苗进行检测,结果符合率达100%。表明,建立的HCLV RT-LAMP技术可以应用于基层实验室或养殖场,便于养殖户对疫苗中的弱毒含量进行监测。     

抗牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其特性研究

利用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因疫苗和重组E2蛋白分别免疫BALB/c小鼠,制备了5株单克隆抗体(4G3、3B2、3F8、2H6、3A11),并对这些单克隆抗体的亚类、免疫原性及其与瘟病毒的反应性进行了检测.结果显示,4G3、382、3F8、2H6为IgM类抗体,3A11为IgG类抗体;纯化后的单克隆抗体与纯化前比较,与抗原的反应性略有提高;5株单克隆抗体与BVDV和猪瘟病毒(CSFV)均有交叉反应性.表明,制备的5株单克隆抗体所针对的是BVDV和CSFV共有的抗原表位.     

猪瘟病毒野毒株E2蛋白特异性单抗免疫抑制制备法的建立

采用环磷酰胺免疫抑制法制备特异性识别猪瘟病毒(CSFV)野毒株的单克隆抗体,用纯化的杆状病毒表达的重组HCLV-E2蛋白作为耐受原,Shimen-E2蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/O骨髓瘤细胞融合,获得了1株能稳定分泌抗E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,结果显示该单克隆抗体能够与CSFV石门株发生反应,同时能与1.1、2.1、2.2和2.3基因亚群CSFV野毒发生特异性反应,并具有中和活性,而与CSFV兔化弱毒疫苗株不发生反应.表明,该单克隆抗体可以用于鉴别CSFV野毒株和兔化弱毒疫苗株.     

猪伪狂犬病病毒经典毒株与变异毒株PCR鉴别方法的建立

猪伪狂犬病是危害世界养猪业的重要疫病之一。近年来我国免疫猪群出现暴发、流行,经证实其抗原性和毒力发生了变异。为了有效区分变异毒株和经典毒株,根据国内外伪狂犬病病毒(PRV)变异毒株和经典毒株基因序列比对结果,针对UL44和UL36区域的基因序列设计了2对引物,建立两步法PCR。第一步PCR针对UL44区域,区分出经典毒株(疫苗株HB98除外)感染与变异毒株感染。第二步PCR针对UL36区域,区分出HB98株与伪狂犬病病毒变异毒株。两步法PCR的敏感度分别达到2~20TCID50和50TCID50病毒量。对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、日本脑炎病毒、脑心肌炎病毒和猪流行性腹泻病毒的核酸应用此方法进行扩增,结果均为阴性。该方法与猪伪狂犬病病毒国家标准PCR检测方法的符合率达到91%,可用于实验室快速诊断。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化,采用PCR技术,对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型(PCV2)感染发病猪场的197份组织病料(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测;同时,对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流感病毒(SIV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的检测,另外,对6个地(市)11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品(脾、肺、淋巴结)进行了PCV2检测。结果显示,在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份,平均阳性率为54.82%(108/197),阳性猪场62个,平均阳性率为63.92%(62/97)。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42.13%(83/197),混合感染的猪场总阳性率为57.73%(56/97)。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2,阳性率为7.10%。由此可见,PCV2感染在广西猪群中已普遍存在,混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪瘟诊断和防制研究进展

猪瘟(Classicalswinefever ,CSF)是严重威胁养猪业、具有重要经济意义的病毒性疾病之一,被国际兽疫局(OIE)列为A类的15种传染病之一。其特征是小血管壁变性,内脏器官多发性出血、坏死和梗塞。该病的病原是猪瘟病毒(CSFV) ,CSFV在分类上属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pes tivirus) ,同属的还有牛病毒性腹泻病毒(Bovineviraldiarrheavirus ,BVDV )和绵羊边界病病毒(Borderdiseasevirus ,BDV ) ,它们在抗原性和结构上与CSFV相似,在血清学上有交叉反应[1] 。CSF遍布于全世界,具有高度接触传染性。目前各国多采用疫苗免疫来…     

酶联免疫吸附试验对猪瘟抗体的监测

猪瘟 (CSF)是危害养猪业最严重的传染病之一 ,自 2 0世纪 5 0年代末我国应用猪瘟兔化弱毒(CSFV)疫苗免疫预防以来 ,有效地控制了其大面积的暴发流行。但近年来温和型、非典型性CSF的发生和免疫失败 ,仍然相当普遍 ,且仔猪的感染呈上升趋势 ,已成为猪病防制中最棘手的问题之一。因此 ,为了查清甘肃省规模养猪场CSF强毒感染状况及检验CSF疫苗的免疫效果 ,笔者应省内某 4个较大规模养猪场的要求 ,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对采自上述 4个猪场的 5 93份猪血清进行了检测。1　材料和方法1.1　诊断试剂　CSF强毒、弱毒单克隆纯化酶联…     

河北省规模猪场猪瘟病毒感染情况及发展趋势的调查

为掌握河北省规模猪场猪瘟病毒(CSFV)的感染情况,并对其发展趋势进行分析,采用RT-PCR方法对2004～2007年250个规模猪场的病料样本进行了猪瘟病原学检测.结果显示,CSFV对河北省规模猪场的危害程度在2004和2005年较重,场总体阳性率分别为100%和55.71%,在2006和2007年较轻,场总体阳性率分别为12.07%和9.26%;对规模猪场的危害程度同猪场的规模呈负相关,与其他病原体混合感染是猪群发病的主要特征,所占比率为60%.基因序列分析表明,危害河北省规模猪场的CSFV是同一毒株的变异株.表明,CSFV对河北省规模猪场的危害程度总体呈逐年下降趋势.     

猪瘟病毒石门株与兔化弱毒疫苗株之间抗原差异的单克隆抗体分析

采用间接免疫荧光方法,用19株抗猪瘟病毒单克隆抗体对猪瘟病毒石门株与疫苗株(兔化弱毒株)的抗原性进行分析.结果显示,9株抗猪瘟病毒E2蛋白的单抗中有4株与2株病毒均反应,但反应程度略有差别;9株抗猪瘟病毒Erns蛋白的单抗中只有3株与2株病毒都反应,其他6株在识别石门株与兔化弱毒株之间存在差别;抗猪瘟病毒NS2/3蛋白的单抗只识别弱毒株.表明,抗猪瘟病毒单抗可用于猪瘟病毒石门株与兔化弱毒疫苗株抗原性差异的分析.     

猪瘟病毒GSLZ株的分离与鉴定

采集甘肃省兰州市某猪场疑似猪瘟样品,将RT-PCR检测为阳性的样品处理后接种PK-15细胞并盲传至第12代,结果在盲传2代之后的细胞培养物中均可检测到猪瘟病毒(CSFV)E2基因.经浓缩、纯化的病毒在电镜下呈约25 nm典型的CSFV病毒粒子,将其命名为GSLZ株.对E2基因核苷酸序列的分析显示,该分离株与标准参考毒株...     

2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析

为掌握广西猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2017-2019年从广西各地采集的腹泻样品,应用RT-PCR方法进行检测,并随机选取部分PEDV阳性样品进行S、M、N基因的扩增、测序和分析。结果显示,共获得PEDV S基因序列23株、M基因和N基因序列各25株。同源性分析显示,广西流行毒株间核苷酸和氨基酸序列同源性在S基因为90.6%~100%和89.6%~100%,在M基因为97.0%~100%和96.9%~100%,在N基因为95.9%~100%和95.9%~100%。序列比对显示,广西流行毒株S1基因的氨基酸序列存在缺失、突变和插入现象,且各毒株之间存在差异。基于S、M、N基因绘制遗传进化树,获得相似的拓扑结构图,广西流行毒株主要分布在S基因的GⅠb、GⅡa亚群,M基因的GⅡa、GⅡb亚群,N基因的GⅢ亚群。遗传进化速率测算显示,广西流行毒株及国内外参考毒株S、M、N基因的平均进化速率分别为7.39×10-4、1.43×10-4和2.96×10-4substitutions/site/year,S基因的变异速度最快。表明PEDV广西流行毒株存在遗传多样性,应加强病原监测和流行病学调查,为有效防控PED提供基础数据。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV218bp片段的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法从BVDV标准毒株OregonC24V中扩增出了218bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、蓝舌病病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10-1TCID50。不同人员用该方法进行检测,结果均一致,表明其重复性好。应用该方法对70份临床疑似发病猪样品进行检测,结果检出11份阳性,阳性检出率约为15.7%。在对5份细胞培养用犊牛血清的检测中,亦检出2份阳性。表明,建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

23株猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区序列差异分析

用RT PCR及测序获得了 17株猪瘟病毒 (HCV) 2 5 1bp的E2基因主要抗原编码区序列 ,经DNAstar软件对获得的 17株HCV及已发表的 6株HCV毒株序列进行了比较和分析 ,并构建了HCV遗传发生树。结果 ,这 2 3株与石门株的序列相比 ,所有毒株的碱基变化随机地分布于整个序列 ,无缺失和插入 ,其中变化较大的区域位于序列的 3′端。 2 3株HCVE2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为 74.1%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 % ,其中 4株 2 0世纪 70～ 80年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 76.3 %～ 86.2 %、81.1%～ 87.8% ,10株 2 0世纪 90年代分离毒株的核苷酸及氨基酸同源性分别为 75 .4%～ 10 0 %、79.7%～ 10 0 %。所绘制的遗传发生树分为 2个组群 (group) ,每个组群分为 2个亚组群 (subgroup) ,14株猪瘟 (HC)流行毒株在 2个组群中均有分布 ,2 0世纪 70～ 80年代分离的 3株 (75 % )在组 群 2 ,2 0世纪 90年代分离的 5株 (5 0 % )在组群 1     

青海省乐都县5种猪病的流行病学和血清学调查

乐都县是青海省主要养猪县 ,以前曾多次流行过猪瘟。为了解近年猪瘟疫情及周边地区流行的一些疫病在本地区猪群中的感染情况 ,笔者在 2 0 0 2年对县内的猪瘟、猪囊尾蚴病、猪布鲁氏菌病、猪伪狂犬病、猪生殖与呼吸综合征 5种疫病进行了流行病学调查和血清学检测。　方法1.1　流行病学调查　在乐都县蒲台、岗沟、洪水、寿乐、共和、雨润、高庙、碾伯、高店、引胜等 10个乡 ,每乡抽查 2个村 ,每村随机检查 2 0户饲养的猪 ,由县、乡两级兽医站技术人员进行调查。1.2　血清学检测　采集上述 10个乡被调查农户及县猪场、牲畜市场 2～ 4月龄猪血液…     

长江中下游地区规模化猪场猪繁殖障碍性疾病的病原学检测

应用PCR与RT-PCR方法,检测了127份来自于长江中下游地区7省市24个规模化猪场患繁殖障碍的病猪的病料,检测病原包括猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及日本脑炎病毒(JEV).结果显示,在上述127份样品中,有10份样品为PRRSV单独感染,占检测样品数的7.87%,有54份样品为PRRSV与PPV混合感染,占样品总数的42.52%,有50份样品为PRRSV与PCV-2混合感染,占样品总数的39.37%;有15份样品为PRRSV与PRV混合感染,占样品总数的11.81%;有8份样品为PRRSV与JEV混合感染,阳性率为6.30%;有18份样品为PRRSV与CSFV混合感染,占样品总数的14.17%.提示,长江中下游地区规模化猪场的猪群普遍存在PRRSV与PPV、PCV-2、JEV及PRV的混合感染.     

牛病毒性腹泻病毒长春分离株P125基因的克隆与序列测定

以MDBK细胞培养致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NCD毒株,采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA,并根据BVDV NADL参考株序列设计合成的1对引物(W1与W2),进行反转录PCR(RT-PCR),扩增出P125基因区约400bp的片段.经pGEM-T载体连接后克隆、测序,并与已发表的NADL、Osloss、SD-1、184、D、H、Yak等BVDV毒株序列进行比较.结果表明NCD株P125基因区无插入或缺失变异,但存在着核苷酸的替换;经聚类分析初步认为NCD株属于Ⅰa型.NCD株与长春184、H株核苷酸序列差异较大,而亲缘关系较近,表明BVDV在同一地区存在不同进化来源的毒株.