延边白鹅IFN-α基因的原核表达及其表达产物生物学活性的研究

以本实验室构建的鹅pMD18-T-IFN-α载体为基础,利用PCR技术扩增得到鹅α干扰素(IFN-α)DNA,经BamHⅠ+SalⅠ双酶切,将其亚克隆到原核表达载体pET-30a上。将构建的重组质粒pET-30aIFN-α转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western-blot分析鉴定;用Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫家兔制备多克隆抗体并进行鉴定。结果显示,PCR扩增出的鹅α干扰素基因全长576bp;成功构建了原核表达载体pET-30a-IFN-α并得到表达;经SDS-PAGE和Western-blot检测,该蛋白的分子质量约为29ku,以纯化后的重组蛋白为抗原免疫家兔,成功制备了多克隆抗体,血清效价为1∶32。本试验为研究鹅IFN-α的作用机理,开发有效防治鹅疾病的新型制剂奠定了基础。     

猪巨细胞病毒gB优势抗原表位区的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备猪巨细胞病毒(PCMV)gB优势抗原表位区重组蛋白的多克隆抗体,进一步分析PCMV gB蛋白的生物学特性,建立PCMV抗体血清学检测方法。对PCMV gB基因优势抗原表位区进行了PCR扩增,将回收的目的片段连接入pET32a(+)表达载体,转化入E.coli Rosetta(DE3),构建了重组表达菌E.coli Rosetta-pET32a(+)-gB,经IPTG诱导表达了gB优势抗原表位区重组蛋白。对重组蛋白进行纯化后,通过Western-blot试验验证了重组蛋白的反应原性,并免疫家兔制备了多克隆抗体。结果表明,该重组蛋白大量可溶性表达,且具有良好的反应原性。琼脂扩散试验及Western-blot检测表明,多克隆抗体效价达到1∶8,且能与gB优势抗原表位区重组蛋白特异性结合。证实,成功制备了PCMV gB优势抗原表位区重组蛋白多克隆抗体。     

抗狂犬病病毒核蛋白单链抗体的表达及活性鉴定

为了获得抗狂犬病病毒(RV)核蛋白(N)的单链抗体,从分泌抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D9中提取总RNA,经RT-PCR扩增得到抗体的轻链可变区基因和重链可变区基因,利用重叠引物延伸法将轻链可变区基因和重链可变区基因连接,同时引入连接肽编码序列,成功扩增得到单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后得到融合蛋白。SDS-PAGE和Western-blot分析结果表明,融合蛋白大小约为32ku,主要以包涵体的形式存在,能被抗His标签的单克隆抗体特异性识别。间接竞争ELISA检测结果表明,该单链抗体能够与RV-His-N重组蛋白和RV结合。抗RV核蛋白单链抗体的成功表达,为单链抗体在狂犬病的诊断和治疗中的进一步研究奠定了基础。     

细粒棘球绦虫重组EG95抗原在绵羊绦虫蚴病血清抗体检测中的应用

为了分析评价细粒棘球绦虫重组蛋白EG95(rEG95)在血清抗体检测上的效果,以细粒棘球绦虫EG95重组质粒pGEM-EG95为模板,经PCR扩增后将目的片段亚克隆至pET-28a(+),构建重组表达载体pET-EG95,在大肠杆菌BL21中表达,SDS-PAGE分离和电洗脱纯化重组表达产物rEG95。建立重组蛋白间接ELISA方法,检测绵羊带绦虫蚴病血清抗体水平。结果表明,表达产物经SDS-PAGE测定分子质量为21ku左右。该蛋白可被棘球蚴病阳性血清特异性识别,表明该表达产物具有反应原性。应用该重组蛋白间接ELISA检测18份脑多头蚴、15份细颈囊尾蚴、20份棘球蚴感染绵羊血清,24份疫苗抗原rEG95免疫羊血清和来自棘球蚴病疫区的179份绵羊血清,其阳性检出率分别是66.67%、80.00%、100%、91.67%和58.2%,而14份健康羊血清反应为阴性,组间差异有一定统计学意义(P<0.05)。表明EG95蛋白可作为绵羊带绦虫蚴病共同保护性抗原和诊断抗原而加以应用。     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

鸭疫里氏杆菌双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为快速检测鸭疫里氏杆菌,以纯化的兔抗1型鸭疫里氏杆菌抗体作为捕获抗体,以纯化的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体作为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。最佳的方案为用184ng/孔纯化的多抗包被过夜,100mL/L小牛血清37℃封闭2h,检测抗原、单抗、酶标抗体均为37℃作用1h,显色20min后终止反应,D450nm值高于0.330且P/N>2.1判定为阳性。该方法特异性强,与禽源巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌无交叉反应,最低检测剂量为104 CFU/mL。与传统细菌分离方法相比,该方法的敏感性为100%,符合率为85.2%。本研究首次建立了检测鸭疫里氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法,且特异、敏感。     

免疫荧光及双抗体夹心ELISA在人狂犬病检测中的应用

目的探讨免疫荧光和双抗体夹心ELISA在人狂犬病检测中的应用。方法4例临床诊断狂犬病死亡患者的大脑、小脑、脑干、海马,分别于冰箱和甲醛固定后保存,用上述方法检测。感染狂犬病毒CVS株的鼠脑组织和急性胰腺炎死者脑组织分别作为阳性和阴性对照。结果-70℃保存的人脑和阳性对照狂犬病毒均为阳性,甲醛固定的人脑和阴性对照均为阴性。结论免疫荧光和双抗体夹心ELISA可用于人狂犬病检测,但脑组织要低温保存,不能用甲醛固定。     

兔抗吗啡多克隆抗体制备

先将吗啡在 6 -羟基位改造为 6 -琥珀酰吗啡 ,再通过碳二亚胺将其与牛血清白蛋白或卵蛋白胶连分别制备免疫原和检测原 ,免疫新西兰大白兔制备出高效价 (1∶ 12 80 0 )抗吗啡多克隆抗体 ,为进一步制备抗吗啡单克隆抗体奠定基础     

猪肺炎霉形体膜蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

通过提取猪肺炎霉形体ATCC25095株膜蛋白,并用免疫亲和层析柱对膜蛋白进行纯化,经SDS-PAGE分析得到了分子质量分别为66、50、46、42、32和24 ku的6种膜蛋白。以纯化的膜蛋白为包被抗原,建立了检测猪肺炎霉形体抗体的间接ELISA检测方法。结果显示,纯化的抗原具有更好的重复性和敏感性,对临床检测样品的检出率高于IDX ELISA试剂盒。     

应用酶联免疫吸附试验检测实验感染绵羊进行性肺炎病毒的山羊血清抗体

用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）在接种绵羊进行性肺炎病毒（ＯＰＰＶ）的山羊血清中可测到ＯＰＰＶ抗体。抗体的最早检出时间是接毒后的第１５ｄ，且４只接毒山羊都呈阳性反应。检测结果表明，ＯＰＰＶ可在山羊体内诱生较强的体液免疫应答反应。试验所用的ＥＬＩＳＡ除可用于ＯＰＰＶ通过山羊体的传代研究之外，还可应用于绵羊进行性肺炎（ＯＰＰ）的诊断