猪附红细胞体PCR-ELISA检测方法的建立

根据猪附红细胞体OxaA膜蛋白基因设计了1对分别标记生物素和地高辛的引物,将PCR扩增产物固定至链霉亲和素包被的酶标板中进行酶联显色检测,并优化PCR扩增及ELISA检测步骤,建立了猪附红细胞体PCR-ELISA。结果显示,该方法较传统的PCR-ELISA节约近2h,最低能检出0.36pg的猪附红细胞体DNA,敏感性比常规PCR高10倍,且与猪链球菌、猪肺炎霉形体、大肠杆菌等无交叉反应。用该方法对64份猪血液中提取的DNA样品进行检测,结果阳性检出率为35.9%,明显高于常规PCR的28.1%。结果表明,建立的猪附红细胞体PCR-ELISA具有敏感、特异、安全和快速的特点。     

单克隆抗体阻断ELISA检测SPF猪与非SPF猪肺炎霉形体抗体的比较

单克隆抗体阻断ＥＬＩＳＡ检测ＳＰＦ猪与非ＳＰＦ猪肺炎霉形体抗体的比较严彩红刘志南（北京市ＳＰＦ猪育种管理中心１０００９５）猪霉形体肺炎是由猪肺炎霉形体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）引起的一种慢性呼吸道传染病，带菌猪是主要传染源。...     

平板乳胶凝集试验快速检测猪肺炎霉形体抗体

我们在试管乳胶凝集(TLA)试验的基础上,又进行了平板乳胶凝集(PLA)试验检测猪肺炎霉形体抗体的研究。 (一)材料和方法 1.10％聚苯乙烯乳胶原液:购自上海市医学化验所。 2.菌种:猪肺炎霉形体ZC株、猪鼻霉形体、猪滑液霉形体冻干菌株均由中国兽药监察所提供。 3.抗原制备:按照本实验室方法自制。 4.血清:以下供试血清用前均经56℃水浴30分钟灭活处理。 (1)兔抗猪肺炎霉形体高免血清:按国际霉形体命名委员会推荐的方法自制。批号:     

猪霉形体病的监控与预警预报

猪霉形体病(Mycoplasmalpneumoniaofswine ,MPS)是由猪肺炎霉形体(Mycoplasmahyopneumo niae)引起的慢性接触性呼吸道传染病[1] ,对养猪业危害极大。笔者试图从病原学、流行病学、临床症状、病理变化等方面对该病的监控和预警预报作一概述。1　病原学关于猪霉形体病的病原,早期有人认为是细菌,以后又有人认为是病毒,直到196 5年,美国的Mare等和英国的Goodwin等在无细胞的人工培养基中培养成功,证实其病原是霉形体,并将该病命名为猪霉形体病或霉形体肺炎。1973年,我国学者也从发病猪体分离到该病原。1.1　猪肺炎霉形体的形态特征猪肺炎霉…     

猪肺炎霉形体Dnak-P97融合基因的表达及其产物的生物学活性

应用DNA重组技术,将猪肺炎霉形体黏附因子P97 C末端基因与猪肺炎霉形体伴侣蛋白Dnak C末端基因同时克隆到pET-30a表达载体上,构建了重组表达载体.将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h.用BugBusterTM Ni-NTA His·Bind纯化试剂盒在自然条件下对目的蛋白进行了纯化;经Western-blotting和动物试验,证实,该蛋白具有良好的生物学活性.     

SDS┐PAGE和免疫印迹技术对绵羊肺炎霉形体和丝状霉形体山羊亚种膜蛋白的分析

ＳＤＳ┐ＰＡＧＥ和免疫印迹技术对绵羊肺炎霉形体和丝状霉形体山羊亚种膜蛋白的分析１）逯忠新邓光明包慧芳梁桂香（中国农业科学院兰州兽医研究所７３００４６）绵羊肺炎霉形体（ｙ－９８，下同）和丝状霉形体山羊亚种（ＰＧ３，下同），都能引起山羊传染性胸膜肺炎，两...     

分泌抗猪肺炎霉形体单克隆抗体杂交瘤细胞的建立

分泌抗猪肺炎霉形体单克隆抗体杂交瘤细胞的建立张顺凤，刘奎（浙江农村技术师范专科学校宁波３１５０４０）（宁波市医科所）猪气喘病是一种传染性慢性肺炎，发病率很高，对仔猪、妊娠猪、哺乳猪危害更大，是威胁养猪业的主要疫病之一，其病源是猪肺炎霉形体。笔者利用淋...     

霉形体检测技术简介

霉形体 (Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ)是一类缺乏细胞壁的原核生物 ,最早分离自牛传染性胸膜肺炎病例 ,初称之为胸膜肺炎微生物 (ＰＰＬＯｓ)。在分类学上 ,霉形体属于原核生物界、软壁菌门、软膜体纲、霉形体目、霉形体科、霉形体属 ,在医学和兽医学上是一类重要的病原微生物 ,对人类及猪、牛、禽和试验动物等有广泛的致病性 ,主要侵害呼吸道和生殖道 ,还有关节、乳腺、眼部。霉形体个体微小 ,结构简单 ,无细胞壁 ,呈多形性形态 ,因而可通过细胞滤器。霉形体还常污染用于生产生物制剂的细胞或鸡胚 ,导致生物制剂品质下降或废弃 ,因此霉形体的检测…     

抗菌新药与疫苗对猪霉形体肺炎的防治效果研究

用氟甲砜霉素等3种抗菌新药及猪霉形体肺炎疫苗对猪肺炎的临床使用方法与防治效果进行了比较.试验结果表明,氟甲砜霉素、普乐健、复方中草药及猪霉形体肺炎疫苗等均能提高试验猪的增重与饲料转化率;普乐健、复方中草药还能显著减轻病猪的症状与病理变化,其防治效果明显优于其他试验组药物.     

猪肺炎霉形体膜制备方法对膜活性影响的研究

以猪肺炎霉形体为材料 ,分别采用反复冻融、低渗裂解、超声破碎等方法进行破膜试验。从膜蛋白收获率、标志酶活性、膜毒性等方面加以分析 ,以探索获取膜制剂的最佳条件。结果表明 ,采用低渗冻融超声相结合的膜制备方法使膜蛋白的收获率达 3 0 %左右 ;ATPase活力及膜毒性良好     

猪捷申病毒8型rVP1-ELISA检测方法的建立

为建立猪捷申病毒(PTV)抗体的间接ELISA检测方法,将PTV-8VP1基因克隆至原核表达载体pET-30a中,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta表达重组的VP1蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析结果表明,表达的重组蛋白分子质量约为36.2ku,且能被PTV-8阳性血清特异性识别。以纯化的重组蛋白包被ELISA反应板,建立了检测PTV抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果表明,重组VP1蛋白与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒阳性血清不发生反应。敏感性试验结果表明血清稀释至1∶800时仍检测为阳性。该方法的批内、批间变异系数均小于10%,表明具有较好的重复性。利用建立的方法对633份临床样品进行检测,阳性率是88.10%。选取58份临床样品与间接免疫荧光方法作比对试验,两者的符合率是94.80%。     

绵羊肺炎霉形体单克隆抗体的研制及初步应用

用绵羊肺炎霉形体（ＭＯ）抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，融合其脾细胞和ＳＰ２／Ｏ骨髓瘤细胞，筛选出６株分泌抗ＭＯ的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞系。用间接ＥＬＩＳＡ法对３株ＭｃＡｂ做特异性分析，该ＭｃＡｂ只特异地与ＭＯ抗原发生反应，而不与猪肺炎霉形体、山羊无乳症霉形体抗原发生反应。用检测ＭＯ抗体的间接ＥＬＩＳＡ与ＩＨＡ比较检测绵羊血清中抗ＭＯ抗体，前者的阳性检出率较后者高７．１４个百分点     

猪SIgA直接ELISA检测方法的建立及应用

采集猪肠黏液并分离纯化出猪分泌型免疫球蛋白A(SIgA),制备兔抗猪SIgA IgG抗体,经HRP标记,并优化直接ELISA检测猪SIgA的条件,建立了检测猪SIgA的直接ELISA方法。结果显示,筛选的最佳反应条件:黏液蛋白包被浓度为10μg/mL,兔抗猪SIgA IgG-HRP酶标抗体的工作浓度为1∶200,反应时间为60min。包被SIgA浓度标准曲线的线性范围为90～1 400ng/mL,回收率为85.85%～133.88%,变异系数为13.12%～17.67%。采用该方法对猪肺炎支原体灭活疫苗免疫与攻毒后的仔猪肺冲洗液和肠黏液中的SIgA进行检测;结果显示,攻毒后免疫猪肺冲洗液中SIgA含量平均为205.81ng/mL,显著高于攻毒对照猪的147.56ng/mL和空白对照猪的124.37ng/mL(P<0.05);免疫猪肠黏液中SIgA含量平均为67.94ng/mL,与对照猪无明显差异。结果证实,建立的猪SIgA直接ELISA方法具有经济、适用和准确的特点。     

猪札幌病毒VP1基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

为了在大肠杆菌中表达猪札幌病毒VP1基因,并以纯化的重组蛋白为抗原建立猪札幌病毒血清抗体ELISA检测方法。采用RT-PCR技术扩增VP1基因,并将其克隆到pMD18-T载体中,再将所克隆的衣壳蛋白的编码序列亚克隆到表达载体pET-28a(+)中,将成功构建的原核表达质粒pETSAVCAP转化大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达。用纯化的VP1蛋白作为抗原建立了猪札幌病毒血清抗体间接ELISA检测方法并初步用于临床样品的检测。结果显示,猪札幌病毒VP1基因可在大肠杆菌中稳定、高效地表达,Western-blot分析表明该重组蛋白具有良好的反应原性。经对反应条件进行优化,确定间接ELISA的抗原最佳包被浓度为0.5μg/mL,且不与其他常见猪病的阳性血清发生交叉反应,建立的ELISA方法具有较好的敏感性、特异性和重复性。通过对从多个省份收集的490份猪血清样品进行检测,阳性率为65.31%。表明,以大肠杆菌表达的猪札幌病毒VP1重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可以用于猪札幌病毒抗体的检测。     

口疮病毒抗体间接ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立检测口疮病毒(orf virus,ORFV)抗体的间接ELISA方法,原核表达口疮病毒B2L蛋白与6×组氨酸标签的重组蛋白;对纯化复性后的重组B2L蛋白进行Western-blot鉴定;用复性后的重组B2L蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立检测ORFV抗体的间接ELISA,并进行特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用所建立的间接ELISA对来自四川部分地区的384份山羊血清样品进行检测。结果显示,成功原核表达出42 ku的重组ORFV B2L蛋白。Western-blot结果表明,重组蛋白具有良好的抗原反应性。间接ELISA最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为5μg/m L,1∶100稀释血清作用2 h,酶标二抗以1∶2000稀释作用30 min,TMB显色时间为15 min。在该优化条件下,D450≥0.31为阳性。该方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性。临床样品的间接ELISA检测结果显示,总阳性率为66.67%(256/384),其中未接种过疫苗的羊只抗体阳性率为34.81%(55/158)。上述结果表明,建立的间接ELISA可用于ORFV抗体的检测,四川部分地区山羊场羊只感染野毒的概率较大,疫苗免疫效果不佳。     

猪生殖与呼吸综合征血清抗体重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

以纯化的猪生殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)重组N蛋白作为包被抗原 ,通过对各项试验条件的优化 ,建立起检测PRRS血清抗体的重组N蛋白间接ELISA检测方法。用此方法检测了2 0 0份血清样品 ,并与IDEXX公司ELISA试剂盒的检测结果相比较 ,敏感性和特异性分别为 93%和95 % ,总符合率达 91%。 2种检测方法的结果之间差异不显著 (P >0 .0 5 )。试验表明 ,建立的间接ELISA检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点 ,可用于PRRS血清抗体的检测。     

猪肺炎支原体P97 C末端蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位分析

以大肠杆菌表达的pET-30a-P97C重组蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,制备针对猪肺炎支原体P97C末端蛋白的单克隆抗体,并将其与截短表达的P97C末端蛋白进行免疫印迹分析,初步鉴定了P97C末端蛋白的抗原表位。进一步采用肽探针扫描技术确定最小抗原决定区域,并通过生长抑制试验及抗黏附特性试验对抗原表位进行了分析。结果显示,获得2株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株A3C9和B4D5,并成功鉴定出P97C末端蛋白的2个独立线性表位F905PMAFSY911和G991TPNQGKKAE1000。2株单抗对猪肺炎支原体的生长均有一定的抑制作用,但对其黏附特性没有显著抑制作用。     

小反刍兽疫病毒N蛋白主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为了建立可特异性地检测血清中抗小反刍兽疫病毒(PRRV)抗体的方法,对具有小反刍兽疫病毒特异性的N蛋白第Ⅳ区域进行扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,用于小反刍兽疫病毒N亚单位重组蛋白的表达。用纯化的重组蛋白作为检测抗原,建立了检测血清中抗小反刍兽疫病毒抗体的间接ELISA方法,并对该间接ELISA的抗原包被量、血清稀释倍数、血清孵育时间等反应条件进行了优化。Western-blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的反应原性。所建立的间接ELISA方法可以鉴别血清中的小反刍兽疫病毒抗体和牛瘟病毒抗体,具有良好的特异性和灵敏性,与标准竞争ELISA试剂盒的符合率达98.4%。证实,本研究建立的检测血清中抗PPRV抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性和灵敏性。     

副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立副猪嗜血杆菌(HPS)的血清学诊断方法,通过探索HPS荚膜多糖产生的最适体外培养条件,提取了HPS血清5型菌株的荚膜多糖(CPS),并以之为抗原分别建立了间接血凝试验(IHA)和间接ELISA两种抗体检测方法,对其特异性、敏感性和符合率进行了比较研究。结果表明,两种检测方法的特异性良好,但ELISA的敏感性是IHA的5~10倍,二者的阳性符合率、阴性符合率和总符合率分别为79.7%、55.2%和65.3%。用这两种方法检测了320份临床送检猪血清,IHA和ELISA的阳性率分别为40%和59%。结果证实,这两种方法适用于不同实验室条件下HPS的诊断和流行病学调查。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测塞内卡病毒VP2蛋白的间接ELISA方法,本试验将A型塞内卡病毒(SVA)VP2蛋白作为抗原包被酶标板,采用棋盘式方法优化反应的最佳血清稀释度和抗原包被量,同时对间接ELISA方法的其他反应条件进行了筛选。结果显示,VP2蛋白包被量为2μg/m L(1∶1000稀释);用2%BSA封闭液稀释标准阳性血清为1∶20;二抗做1∶5000稀释;TMB底物显色液室温避光显色反应10 min。特异性试验结果显示,同FMDV、PRRSV、CSFV、PRV和APP阳性血清均无交叉反应。此方法对塞内卡病毒阳性血清的敏感性为1∶160。批间、批内重复性试验结果的变异系数均小于10%。对200份猪血清样本分别进行间接荧光抗体免疫方法和间接ELISA方法的检测,结果符合率为95.5%。上述结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于塞内卡病毒血清抗体检测和流行病学调查。