类弹性蛋白和Mxe内含肽介导的非洲猪瘟病毒重组蛋白K205R的表达与纯化

为了构建Mxe内含肽(mxe intein,MI)和类弹性蛋白(elastin-like peptide,ELP)介导的重组蛋白表达与纯化系统,将PCR扩增的MI序列和限制性内切酶切取的ELP序列插入原核表达载体pET-30a,获得融合表达载体pET-MIE;将PCR扩增的非洲猪瘟病毒(ASFV)K205R基因插入pET-MIE载体,获得重组载体pET-K205R-MIE;分别将pET-MIE和pET-K205R-MIE转化大肠杆菌,对其重组蛋白表达、逆向相变循环沉淀及MI自体裂解条件进行优化。结果显示,在20℃条件下K205R-MIE融合蛋白为可溶性表达,26℃条件下逆向相变循环沉淀融合蛋白的回收率达73.2%,26℃孵育4h的裂解效率达91.4%,K205R蛋白的回收率为51.3%,纯度高达92.2%,能被ASFV免疫血清识别。结果提示,成功构建了简单、经济的重组蛋白表达与纯化系统,制备的K205R抗原可用于ASFV诊断。     

猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析试纸条的研制及初步应用

为建立一种简便、快捷、特异、敏感的猪瘟病毒(CSFV)E2抗体的胶体金检测方法,本研究将E2蛋白用胶体金颗粒标记,作为金标抗原,将E2蛋白及其单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜(NC)上,分别作为检测线(T线)和质控线(C线),组装成检测猪瘟E2蛋白抗体的胶体金免疫层析试纸条.结果 显示,该试纸条可在5～10 min完成检测...     

非洲猪瘟病毒pO174L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

为了解析非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)pO174L蛋白的功能,根据ASFV HLJ/18毒株基因序列(GenBank登录号:MK333180)设计引物,扩增O174L基因并克隆至pET-28a(+)载体中,构建原核表达载体pET-28a-O174L,并将其转化至大肠杆菌BL...     

猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗保护剂的研究

自1988年我厂对冻干疫苗保护剂和冻干产品生产工艺进行了研究。以猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞苗为主进行了保护剂的筛选试验,找出一种保护剂配制方法、冻干曲线和时间及营养血清的配制等新工艺。用这种方法生产的猪瘟细胞的毒冻干苗在37℃环境中可保存10天,在22～25℃条件下可保存35天,0～4℃条件下可保护22个月,达到了国外同类苗的水平。     

猪瘟病毒遗传发生关系分析

利用反转录（ＲＴ）及ＰＣＲ扩增并测定了中国猪瘟兔化弱毒（Ｃ－株）兔组织毒、Ｃ－株细胞疫苗毒和近期（１９９７～１９９８年）甘肃省７个地区的１０个流行野毒株的Ｅ２基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：Ｃ－株兔组织毒、Ｃ－株细胞毒和中国５０～６０年代流行的石门强毒株同属于组群１（Ｇｒｏｕｐ１）;近期猪瘟流行毒株同属于组群２（Ｇｒｏｕｐ２）的两个不同的亚组群（Ｓｕｂｇｒｏｕｐ２．１和２．２）,其流行毒株与疫苗毒株有较大的差异（Ｅ２全基因核苷酸序列同源性８２．２％～８４．３％）,表明猪瘟流行毒株向远离疫苗毒株的方向演变。     

白细胞介素3对猪瘟病毒E_2基因疫苗免疫增强作用的研究

以昆明系小白鼠为试验动物,观察了白细胞介素３（ＩＬ３） 对猪瘟病毒Ｅ２ 囊膜糖蛋白（ ＨＣＶ Ｅ２） 基因疫苗免疫效果的增强作用。用ＤＮＡ 重组技术将ＨＣＶ Ｅ２ 基因和小白鼠ＩＬ３ 基因克隆到ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ 质粒,因在两者之间有脑心肌炎病毒（ＥＭＣＶ） 的核糖体进入位点（ＩＲＥＳ） 片段,可得到ＨＣＶ Ｅ２ 基因和小白鼠ＩＬ３ 基因双表达质粒ｐＩＲＳＴ ＩＬ３ ,用ｐＩＲＳＴＩＬ３ 免疫小白鼠后,经ＥＬＩＳＡ 法检测免疫小白鼠血清中抗ＨＣＶ Ｅ２ 抗体效价。结果显示,ＩＬ３ 能显著提高ＨＣＶ Ｅ２ 基因疫苗的免疫效果,表明ＩＬ３ 可作为ＨＣＶ Ｅ２ 基因疫苗的细胞因子佐剂。     

表达猪瘟病毒E2蛋白的三种重组腺病毒在兔体上的免疫效力比较

为了筛选1株免疫效果好的候选猪瘟疫苗,在家兔模型上对表达猪瘟病毒E2基因的3种重组腺病毒(rAdV-E2、rAdV-optiE2和rAdV-E2UL49)进行了免疫效力评价,从抗体、攻毒后产生定型热反应以及兔脾中病毒载量等几个方面进行了比较。结果显示,rAdV-E2UL49免疫组(n=5)在免疫后第2周,3只家兔产生了特异性的猪瘟抗体,免疫后第4周,所有免疫家兔的抗体阻断率均达到了70%;相比之下,rAdV-E2和rAdV-optiE2免疫组(n=5)家兔在免疫后第4周,只有个别家兔检测到了猪瘟特异性抗体。用猪瘟弱毒疫苗(C株)攻毒后,rAdV-E2UL49免疫组家兔均未出现定型热反应,在其脾中也未检测到C株病毒RNA,其免疫效果接近于C株;rAdV-E2和rAdV-optiE2免疫组各有3只家兔出现了定型热反应,在个别兔的脾中检测到了病毒RNA。结果表明,伪狂犬病病毒UL49基因编码的VP22蛋白可以增强重组腺病毒的免疫原性,rAdV-E2UL49有望成为一株有潜力的猪瘟疫苗。     

非洲猪瘟病毒P54基因原核表达载体的构建与表达

根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)P54基因序列,设计合成了2对引物,采用PCR方法从ASFV DNA中分别扩增出了P54基因片段和经过改造的跨膜信号肽缺失的P54基因,将其克隆到表达载体pET28b中,构建了重组质粒pET-P54和pET-P54q,测序验证后转化入表达宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE,Western-blotting检测.结果显示,经过改造的信号肽缺失的重组菌pET-P54q可表达出分子质量约24.5 ku的重组融合蛋白,表达的蛋白以可溶形式存在于菌体中,经镍柱亲和层析纯化可获得纯度较高的目的蛋白.纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应,证实,表达的蛋白具有较好的反应原性.     

河北省规模猪场猪瘟病毒感染情况及发展趋势的调查

为掌握河北省规模猪场猪瘟病毒(CSFV)的感染情况,并对其发展趋势进行分析,采用RT-PCR方法对2004～2007年250个规模猪场的病料样本进行了猪瘟病原学检测.结果显示,CSFV对河北省规模猪场的危害程度在2004和2005年较重,场总体阳性率分别为100%和55.71%,在2006和2007年较轻,场总体阳性率分别为12.07%和9.26%;对规模猪场的危害程度同猪场的规模呈负相关,与其他病原体混合感染是猪群发病的主要特征,所占比率为60%.基因序列分析表明,危害河北省规模猪场的CSFV是同一毒株的变异株.表明,CSFV对河北省规模猪场的危害程度总体呈逐年下降趋势.     

非洲猪瘟病毒荧光量子点检测试纸条的研制

根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72蛋白的氨基酸序列筛选合成多肽,并与载体蛋白BSA进行偶联,将以此得到的多肽作为抗原免疫小鼠,用来制备鼠源抗ASFV VP72蛋白的单克隆抗体。将上述方法制备的针对ASFV VP72蛋白的单抗作为荧光量子点标记的抗体,以与这种标记单抗互相配对的另一单抗包被检测线（T线）,采用山羊抗鼠二抗Ig G包被质控线（C线）,建立了一种简便、快速、准确的用于ASFV抗原检测的荧光量子点免疫层析试纸条。结果表明,制备的试纸条对于猪瘟等8种猪常见疫病免疫用灭活疫苗检测时无交叉反应;可检测到8μg/m L的VP72重组蛋白;与商品化的ASFV荧光定量PCR检测试剂盒进行比对检测,其对临床样品检测的阳性符合率为82.1%(23/28),阴性符合率为93.8%(75/80)。该试纸条特异性好、灵敏度高以及稳定性好,为ASFV的现场快速初步诊断提供了一种技术支持。