鸭肠炎病毒UL6基因B细胞表位的预测及其主要抗原域的原核表达

采用DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对鸭肠炎病毒(DEV)CHv毒株UL6基因(GenBank登录号EF055890)的氨基酸序列进行了B细胞表位预测。结果显示,UL6蛋白羧基端第Thr507~Gln515、Thr521~Met529、Asp531~Phe539、Gly544~Asn562、Thr568~Gln585、Lys592~Val604、Ala681~Ala778和Tyr780~Lys790区域内含有优势B细胞表位。以DEVCHv毒株基因组作为PCR模板,利用Oligo6.0软件设计了1对引物,整体扩增涵盖上述具有优势表位的基因片段,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,获得表达载体pET-32a-UL6M,再将其转化至E.coliRosetta(DE3),经IPTG诱导,外源基因获得了良好表达。以兔抗DEV多克隆血清进行Western-blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应。提示,该氨基酸片段可能含有软件预测的线性表位区。     

CELO病毒fiber1基因部分片段的原核表达及抗原性鉴定

根据鸡胚致死孤儿(CELO)病毒Phelps株的fiber1基因(GenBank序列号U46933)序列设计了1对引物,采用PCR扩增CELO病毒fiber1基因C端(包含Knobs区)的部分片段,并将其克隆到质粒表达载体pGEX6p1,获得的阳性克隆命名为pGEXAF807。序列分析表明,所获得的DNA片段核苷酸序列与CELO病毒Phelps株的fiber1基因序列完全一致。将pGEXAF807转化大肠埃希氏菌DH5α,经37℃、0.6mmol/LIPTG诱导表达5h,SDSPAGE分析超声裂解后的上清和沉淀。结果显示,目的蛋白以包涵体形式存在,蛋白分子质量约为54.6ku,目的蛋白量占菌体总蛋白的35.7%。用CELO病毒多克隆血清做Westernblotting试验,结果表明目的蛋白具有较好的抗原活性。     

鸡传染性支气管炎病毒四川分离株N基因DNA免疫质粒的构建

采用SDS 蛋白酶K法抽提鸡传染性支气管炎病毒(IBV)四川分离株SAIBWJ的基因组RNA,参照基因库中的N基因序列设计了1对引物,扩增出了单一的DNA产物。将该产物插入pUC18载体的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,构建了pUC NWJ质粒。序列测定结果表明,获得的克隆质粒包含了全部N基因。再将N基因亚克隆到pcDNA3.1( )载体的HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,构建了IBVSAIBWJN基因的DNA免疫质粒pcDNA NWJ。     

猪圆环病毒2型猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒三重PCR检测方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2、猪伪狂犬病病毒(PRV)gD和猪细小病毒(PPV)VP2基因保守区域,设计了特异性引物,在分别建立单一病毒基因PCR检测方法的基础上,通过对3组引物的比例和浓度、dNTPs和Mg2 浓度、退火温度等条件的优化,建立了针对上述3种病毒的三重PCR检测方法。敏感性试验表明,应用该方法最低可检测到4×10-4ng/μL的PRV双链DNA模板和2×10-5ng/μL的PCV2和PPV单链DNA模板。对21份自然感染病猪样品的检测结果表明,该三重PCR检测结果与单一PCR检测的结果完全符合。试验结果显示,建立的三重PCR方法可用于3种DNA病毒的同时检测,具有快速、准确的特点,有临床应用前景。     

不同家禽红细胞悬液对禽流感血清抗体检测的影响

为探讨不同家禽红细胞对禽流感血清抗体检测的影响,对不同家禽的禽流感阳性血清分别经不同方法处理后,做了一系列对比试验。结果发现,经受体破坏酶(RDE)处理后,虽然可以消除异种家禽血清对异种家禽红细胞的非特异性凝集作用的影响,但因处理复杂,费用高,不宜推广应用;经鸡红细胞吸附处理,可明显降低水禽血清对异种红细胞的非特异性凝集作用,但处理费时;而用水禽红细胞检测同种水禽的禽流感血清抗体,可以有效去除血清非特异性凝集的影响,且更能准确地反映水禽经禽流感疫苗免疫后的抗体水平。因而,应选用与宿主来源相同的红细胞悬液检测水禽禽流感血清抗体。     

保妇康栓治疗伴有人乳头瘤病毒感染的宫颈上皮内瘤Ⅰ型38例

目的:观察中药保妇康栓治疗伴有人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染的宫颈上皮内瘤(cervical intraepithelial neoplasia,CIN )Ⅰ型患者的临床疗效.方法:伴有HPV感染的CIN Ⅰ型 76例患者被随机分成治疗组和对照组.治疗组予中药保妇康栓阴道内置药3个月,治疗后行液基细胞学检查(liquid based cytology test,LCT)及电子阴道镜检查.对照组不使用任何药物,3个月后行LCT及电子阴道镜检查.结果:3个月后LCT示治疗组HPV感染转阴率为71.05%,与对照组自然消退率(50.00%)比较,差异具有显著性(P<0.05).电子阴道镜检查示治疗组55.27%的CIN Ⅰ型转为慢性炎症,与对照组(34.21%)比较,差异具有显著性(P<0.05),结论:保妇康栓对轻度宫颈病变有一定的治疗作用.     

H7N2禽流感病毒分离株血凝素蛋白全基因的序列分析

为进一步分析H7N2禽流感病毒(AIV)分离株血凝素(HA)基因的特性,参照已发表序列设计了1对引物,采用RT-PCR获得了1条约1.7 kb的DNA片段,测序后进行了同源性比较、HA基因系统发育进化树分析和氨基酸编码分析。结果表明,所测的2个分离株的HA基因全长1 664 bp,编码除信号肽以外的HA蛋白的全部544个氨基酸,其中包括HA1的323个氨基酸,HA2的221个氨基酸。2个分离株HA基因核苷酸序列的同源性为99.4%;与GenBank中AIV标准株A/Afri.Star./Eng-Q/983/79(H7N1)的同源性最高,分别为99.4%和99.0%;与美国A/Chicken/NewYork/13142-5/94(H7N2)株同源性很低(仅65.0%),而与以色列、意大利H7N2AIV的同源性较高(为96%~97%);2个分离株在HA基因进化树中均处于H7亚型AIV的欧亚群系分支内。推导氨基酸的序列分析表明,其HA蛋白裂解位点的氨基酸序列为-GR-GLF-,仅包含1个碱性氨基酸(R-)残基,符合低致病力AIV的基因特征。     

口蹄疫病毒结构蛋白VP2-3-1的纯化复性与活性检测

收集含有口蹄疫病毒结构蛋白VP2 3 1基因的大肠埃希氏菌菌液 ,将其超声破壁 ,用菌体裂解液裂解 ,提取包涵体 ,并用 8mol/L尿素溶解 ,收集上清液 ,用亲和层析法纯化融合蛋白VP2 3 1 ,透析法复性 ,并用间接ELISA检测FMDV阳性血清和阴性血清。结果 ,P/N值大于 2 .1 ,说明纯化复性后的目的蛋白有一定的生物活性     

猪瘟病毒E2蛋白B细胞识别基序的筛选

根据猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白的序列设计并人工合成18条重叠多肽,与载体蛋白BSA偶联后,利用抗CSFV E2蛋白单克隆抗体SWmAb8筛选该蛋白上的B细胞表位;同时用12肽噬菌体随机肽库淘选E2单抗识别多肽序列。结果显示,多肽序列VSPTTLRTEV能被单抗SWmAb8识别;含SPTxLR基序的噬菌体能被单抗SWmAb8结合,且能被病毒抗原竞争性抑制。证实SPTxLR基序很可能是E2蛋白的线性表位之一,可诱导机体产生中和抗体。     

伪狂犬病病毒Min-A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒 (PRV) gE基因的序列设计了 1对引物 ,对PRVMin A株进行了PCR扩增 ,扩增产物克隆于 pGEM TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序 ,证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明 ,目的片段包含 1个 174 0bp的开放性阅读框(ORF) ,编码由 5 79个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明 ,PRVMin A株与PRVEa株、SH株gE基因的核苷酸同源性分别为 99.2 %、98.7% ;推导氨基酸的同源性分别为 98.6 %、97.2 %。