胸膜肺炎放线杆菌apx I A基因在不同宿主系统中的表达及密码子偏好性分析

用PCR方法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型参考株APP259的基因组DNA中,扩增了约954 bp的apx I A基因片段,分别构建了大肠杆菌表达栽体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A.对目的基因密码子偏好性进行了分析,发现其中有4个大肠杆菌稀有密码子,占1.2%;有49个毕赤酵母稀有密码子,占15.4%.利用所构建的大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1/apx I A和毕赤酵母表达载体pPICZαA/apx I A分别进行表达.结果显示,目的基因在大肠杆菌中能以包涵体形式进行高效表达,其融合蛋白占菌体总蛋白的32%;在毕赤酵母中则以较低水平分泌表达至培养基的上清液中,40倍浓缩后方能检测到少量目的蛋白.证实,目的基因序列中的密码子偏好性影响其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达.     

四种血清型胸膜肺炎放线杆菌多重PCR检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜蛋白OmlA序列设计种特异性引物,根据血清型1、2、6、7荚膜多糖(CPS)序列分别设计型特异性引物,通过优化PCR扩增条件,分别扩增出OmlA(952 bp)、CPS1(630bp)、CPS2(504 bp)、CPS6(720 bp)、CPS7(389 bp)特异性片段,建立了既可对APP进行定性检测又可对APP 1、2、6、7进行定型检测的多重PCR.特异性试验表明,此多重PCR能从APP 1～4、6～10标准株中扩增出与引物相应的特异性片段;对猪副嗜血杆菌、猪肺炎霉形体、多杀性巴氏杆菌、肠炎沙门菌、猪链球菌、大肠杆菌和猪丹毒杆菌进行扩增,均未扩增出片段.敏感性试验表明,此多重PCR能够检测到DNA的量为10 pg.45头疑似病猪病料的细菌分离鉴定结果与此多重PCR的鉴定结果一致.上述结果表明,建立的多重PCR适合于APP 1、2、6、7的鉴别诊断及流行病学调查.     

茜草素的抗菌活性与药效试验

用化学合成的茜草素做了体外抑菌试验、体内抗菌活性试验、人工感染猪多杀巴氏杆菌疗效试验、急性毒性试验及临床治疗试验。结果表明,茜草素在体外对金黄色葡萄球菌、变形杆菌、大肠埃希氏菌、绿脓杆菌、沙门菌和克雷伯氏菌等均有显著的抑制作用,对后4种病原菌的抑制作用超过了六茜素。在小白鼠体内对大肠埃希氏菌也有非常显著的抗菌作用。对人工感染多杀巴氏杆菌的患病仔猪有显著的治疗作用。小白鼠腹腔注射茜草素的LD50为336 mg/kg。茜草素对临床型乳牛乳腺炎的治愈率为87.5%,总有效率为100%。     

地衣芽孢杆菌对坏死性肠炎雏鸡回肠组织及细胞因子的影响

为了探讨地衣芽孢杆菌对坏死性肠炎雏鸡回肠组织及细胞因子的影响,选用1日龄铁脚麻鸡120只,随机将其分为对照组、感染组、预防组(1g/kg菌粉Ⅰ),治疗组(0.5g/kg菌粉Ⅰ+4g/kg菌粉Ⅱ)。感染组、预防组、治疗组15日龄灌喂球虫,17~20日龄灌喂产气荚膜梭菌(1×108CFU/mL)1mL,对照组灌喂相同剂量生理盐水。采用Real-time PCR方法检测回肠组织中IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6等4种细胞因子的表达水平,切片观察回肠组织变化。结果,产气荚膜梭菌的攻毒使雏鸡外周血白细胞及回肠组织细胞因子显著增加,回肠组织切片可见明显病变。地衣芽孢杆菌的补充减少了肠道病变及外周血白细胞数量。此外,与感染组相比,治疗组IFN-γ、IL-1β、IL-6的表达水平均显著降低,而预防组仅IL-1β显著低于感染组,其他细胞因子的表达无差异。结果表明,地衣芽孢杆菌对试验性雏鸡坏死性肠炎的防治具有促进作用。     

鸭菌消治疗鸭传染性浆膜炎的研究

不同地区和同一鸭场隔3个月分离的鸭疫里氏杆菌(RA)菌株对氯霉素、氨苄青霉素、氟哌酸等的敏感性有显著差异,新兽药鸭菌消对RA高度敏感,抑菌圈直径达37 mm,对人工感染和临床病例治疗试验结果,治愈率分别达95.0%和91.2%,比氯霉素、氟哌酸、青霉素的平均治愈率高46个百分点,在各地推广应用200多万羽份,效果良好.     

猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及其应用

设计了 1对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养 ,然后挑菌做PCR ,同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果 ,从不同省 (市 )的送检病料中分离鉴定出 6 6株多杀性巴氏杆菌 ,PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合 ;该引物对其他 6种猪的常见呼吸道病原菌的扩增结果均为阴性 ;该PCR检测方法能检出CFU为 10 3/mL的巴氏杆菌模板。     

牛分支杆菌MPT83基因的表达及重组蛋白的纯化

从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T Simple Vector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化。经测序,构建的克隆质粒pMD-MPT83与Gen- Bank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamHⅠ HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Western- blotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带。表明MPT83基因原核表达载体构建成功。     

羊毛皮张和土壤中炭疽杆菌PCR检测方法的建立

建立了检测炭疽芽孢杆菌染色体特异性基因序列 (Ba813)的PCR技术 ,并用于模拟污染的羊毛、皮张和土壤中炭疽芽孢 (Sterne菌株、PasteurⅡ菌株 )的检测。结果表明 ,该方法可特异、敏感地检出 0 .5 g羊毛中Sterne菌株的 4 5 2个芽孢和PasteurⅡ菌株的 6 88个芽孢 ;0 .5g皮张中Sterne菌株的 4 5 2个芽孢和PasteurⅡ菌株的 10 32个芽孢 ;0 .5 g土壤中Sterne菌株的 4 5 2个芽孢和PasteurⅡ菌株 1376个芽孢。证实PCR可用于羊毛、皮张和土壤等外环境中炭疽杆菌芽孢的检测。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌 (APP) 7型的DNA提取物中扩增出大小为 2 873bp的APXⅡA基因片段 ;将PCR产物重组到质粒载体 pMD 18 T中 ,并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明 ,克隆片段为完整的目的基因 ,该片段的核苷酸序列与国外分离株M 30 6 0 2的同源性达 99.7%。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

通过实验室检验 ,从福建省 2个送检猪场猪的肝、脾病料中分离出 2株猪胸膜肺炎放线杆菌 ,结合临床表现 ,推断它们均具有较强的致病性