猪水泡病病毒结构蛋白基因的克隆及其蛋白二级结构和淋巴细胞表位的预测

以免疫信息学和反向疫苗学为理论根据,利用RT-PCR法获得了猪水泡病病毒(SVDV)HK/70株的基因组序列并测序,应用生物信息学相关软件和方法,对SVDV结构蛋白的二级结构的不同方面及其抗原特异性淋巴细胞表位进行了预测,综合评价了SVDV结构蛋白的抗原特异性细胞表位,并计算出一些潜在的抗原位点。结果表明,VP1蛋白含有的细胞优势抗原表位最多,但其他结构蛋白也含有抗原特异性淋巴细胞表位,有的甚至有可能成为优势抗原表位或对优势抗原表位有协同作用。     

口蹄疫病毒P1 2A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建

以A型口蹄疫病毒(FMDV)AV88(L)和XJ99株的P12X基因和AV88(L)3C基因的阳性克隆质粒为模板,用PCR扩增各基因片段,酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明,获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88(L)P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C,为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。     

宁夏地区猪生殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆及其变异分析

参考GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Jiangxi株和CH-la株的ORF5基因序列,设计并合成了1对引物,对宁夏回族自治区送检的18份PRRS阳性分离毒株进行RT-PCR扩增,获得约750 bp的DNA片段,将其分别克隆入pMD18-T栽体中,进行测序.应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCC VR-2332,BJ-4,RespPRRS MLV等毒株的ORF5序列进行比较,发现其核苷酸同源性为85.4%/～89.0%,与CH-la之间的核苷酸同源性为90.0%～98.2%,与欧洲代表株I,V的核苷酸同源性为55.9%～56.6%.基因系统进化树分析表明,发生于宁夏回族自治区的PRRSV属于美洲型,与CH-la遗传关系较近,归属同一基因亚型.     

猪瘟RT-PCR ELISA诊断方法的建立及其初步应用

建立了检测CSFV的快速、敏感、特异的RT PCRELISA方法。在RT PCR过程中以地高辛标记的dUTP(DIG dUTP)标记PCR产物 ,用生物素标记的捕获探针在链亲和素包被微量板孔中杂交捕获PCR产物。该方法的敏感性较常规RT PCR方法高 10 0倍 ,可检测出 35 0 μL1∶10 0 (相当于 3.5mg)的兔脾组织悬液中的C株CSFV ,特异性强 ,避免了PCR过程中因污染导致的假阳性结果。通过对RT PCR和微量杂交系统的条件优化 ,该方法用于检测C株兔脾组织毒、细胞适应毒和野毒感染的猪组织毒样品 ,效果良好     

不同佐剂乳牛乳腺炎多联灭活疫苗的免疫试验

用 4种不同佐剂乳牛乳腺炎多联疫苗进行兔免疫攻毒试验。结果 ,蜂胶疫苗效果最好 ,铝胶疫苗次之。对昆明系小白鼠注射蜂胶疫苗和铝胶疫苗后第 30d金黄色葡萄球菌抗体水平达到最高 ,无乳链球菌和停乳链球菌抗体在第 2 1d达到峰值。在免疫健康泌乳牛的试验中 ,3种佐剂疫苗的免疫效果依次为蜂胶疫苗、油疫苗和铝胶疫苗 ;与对照组相比 ,免疫效果均显著 (P <0 .0 5 )。     

猪瘟病毒E2基因与报告基因lacZ双表达质粒的构建及体外表达

利用反转录和套式PCR技术,从猪瘟病毒(CSFV)石门血毒中扩增出了E2 基因,将其用NotⅠ和XhoⅠ双酶切后,与同样处理的真核表达载体pBudCE4.1 相连,获得了pBudCE Es2 22的阳性质粒。对后者再以HindⅢ和XbaⅠ双酶切,并与来自质粒pBudCE lacZ/CAT的lacZ基因片段连接,获得了含CSFV E2基因与lacZ报告基因的真核双表达质粒pBudCE lacZ/Es2 22。该质粒转染BHK21细胞后,用βGal Staining试剂盒原位染色可见许多着染蓝色的细胞;用CSFVAntigen试剂盒检测转染细胞的上清液和细胞沉淀,均可检测到含CSFV E2 抗原。结果表明,构建的真核质粒pBudCE lacZ/Es2 22实现了2个外源基因的共表达。     

猪圆环病毒2型和猪生殖与呼吸综合征病毒混合感染的检测

对采自甘肃省天水市某猪场的24份病猪组织器官样品(肺、脾、肾和淋巴结)进行了病毒分离,同时设计特异性引物,建立了分别检测猪圆环病毒2型(PCV-2)和猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的PCR和RT-PCR方法,应用ELISA方法检测了血清中PCV-2及PRRSV抗体,以调查该猪场PCV-2和PRRSV混合感染的情况.结果显示,有14份样品均扩增出了PCV一2和PRRSV的目的基因片段,且PCV-2及PRRSV抗体均呈阳性.证实,该猪场出现了PCV-2和PRRSV的混合感染,阳性率为58.33%.     

猪生殖与呼吸综合征病毒HN/XT/07株的分离鉴定及其Nsp2基因的特性分析

从湖南湘潭某发病猪场分离到1株病毒,该病毒可使Marc-145细胞产生CPE,应用猪生殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒从感染细胞培养物中检测到猪生殖与呼吸综合征病毒,并将该分离毒株命名为HN/XT/07。采用RT-PCR方法扩增该分离毒株的Nsp2基因,并进行序列测定,发现在2932～3031 bp之间不连续缺失了87个核苷酸。序列比对结果显示,该分离毒Nsp2基因与PRRSV经典毒株Ch-1a的核苷酸同源性为85.5%,氨基酸同源性为80.1%;与2006～2007年流行的PRRSV高致病性变异毒株NX和SD的核苷酸同源性为95.3%～96.4%,氨基酸同源性为90.9%～95.6%。     

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建

为进一步研究猪圆环病毒2型(PCV2)的致病机制和基因功能,利用PCR方法从河北保定株(HBBD0608)猪PCV2病料中获得了PCV2全基因组序列,将其定向克隆入pEGFP-N1载体,成功构建了PCV2全基因组串联双拷贝的重组质粒pEGFP-N1-2PCV2.将该质粒转染PK-15细胞并连续盲传5代,用PCR方法可以在转染后盲传的细胞中检测到PCV2核酸;间接免疫荧光可以检测到绿色荧光,表明有PCV2抗原存在.证明构建的双拷贝重组质粒具有感染性.     

2007-2010年间我国西北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子流行病学调查

在过去的两个时间段内,作者从我国西北地区的15个猪场分离出32个病原样品,通过基因分子检测和测序分析以确定猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的感染和PRRSV的基因型。结果显示,PRRSV阳性检出率为35.9%,2007-2008年和2009-2010年的平均发病率分别为46.5%和29.3%。依据GP5完整基因的核苷酸序列所做的遗传进化树分析表明,所有的32株PRRSV田间流行株的基因型都属于北美洲型,且属于高致病性的PRRSV亚型。分离自新疆的毒株形成一个相对密切的基因分支,与以BJ0706株为代表的分子进化中间型的其他分离株也有较为密切的进化关系。此外,通过比较2007-2008年和2009-2010年分离自同一养猪场的毒株,发现16个分离株中15株表现相同的氨基酸突变,即V29→A29和N34→S34。调查结果表明,自2007年到2010年间PRRSV在我国西北地区和其他地区相继出现,而且显示一定的地域特征。同时,2009年之后的分离株在GP5基因上出现新的氨基酸突变。