B细胞分离方法的研究进展

B细胞是重要的免疫细胞,如何筛选和分离分泌抗体的抗原特异性B细胞,对于研制一些特殊功能的抗体具有重要的方法学意义。本文阐述了不同发育阶段B细胞的表面分子特征与种属差异,以及基于这些表面分子的不同B细胞分离方法的原理与优缺点,旨在为抗原特异性B细胞的分离提供参考。     

口蹄疫病毒O型和A型交互反应性单克隆抗体的筛选与鉴定

不同血清型口蹄疫病毒(FMDV)之间不能产生交叉免疫保护,但是血清学的交叉反应确实存在。本研究旨在建立一种筛选型间交互反应性抗体的方法,以期为解析FMDV血清型间保守的抗原结构奠定基础。本方法主要依据单个B细胞抗体技术,首先采用两种不同的荧光染料FluoProbes 647H和Pacific Blue分别标记O型与A型FMDV 146S灭活抗原,然后利用流式细胞分选技术,从免疫牛外周血单个核细胞(PBMCs)中分选出结合两种抗原的特异性B细胞,通过单个B细胞抗体基因测定,获得Ig G抗体重链与轻链可变区编码序列,并将可变区基因插入含有牛IgG抗体恒定区的pcDNA3.4载体中,构建IgG抗体的重链与轻链表达质粒。将重链与轻链表达质粒共转染中国仓鼠卵巢悬浮细胞(CHO-S)进行完整抗体表达。结果显示,通过该方法获得了5株FMDV特异性单克隆抗体,其中4株(H64、R82、I16、R29)经间接免疫荧光(IFA)检测都可特异性识别O和A型FMDV;ELISA结果显示,H64、R82、I16与O、A型抗原均具有较好的亲合力;Western-blot结果显示,I16可特异性结合O、A型FMDV结构蛋白VP2中的线性表位,说明在衣壳蛋白VP2上存在血清型间保守的抗原表位,通过本研究进一步加深了对FMDV抗原结构的认识。     

口蹄疫病毒多基因腺病毒穿梭质粒的构建

采用分步扩增连接的方法将口蹄疫病毒结构蛋白基因P1 2A、3C蛋白酶基因和 3D聚合酶基因按正确的读码框依次连接克隆入 pGEM T载体。然后 ,将切取的目的基因亚克隆入腺病毒穿梭质粒 pShuttle CMV。构建成功的 2个重组穿梭质粒经测序鉴定 ,含有完整的目的基因表达盒 ,穿梭质粒可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组 ,以产生重组腺病毒载体     

B细胞永生化方法的研究进展

B细胞永生化是一个历久弥新的研究课题,如何维持B细胞体外连续传代增殖并表达抗体的特性,对于研制治疗和诊断用抗体类药物和制品具有重要的意义。B细胞永生化的方法包括杂交瘤技术,EB病毒或SV40感染永生化以及遗传修饰法。永生化B细胞能快速有效的产生单克隆抗体,这种抗体能克服异源抗体产生的免疫排斥,是制备单克隆抗体的理想来源,成为研制治疗性单抗的重要方法。本文主要概述了B细胞永生化方法的研究进展与未来的发展方向,以供从事这方面研究的人员参考。     

口蹄疫病毒研究概况

长期以来 ,世界各国对口蹄疫 (ＦＭＤ)防制十分重视 ,进行了广泛深入的研究 ,但近年来 ,本病在一些国家和地区频繁暴发流行 ,造成了巨大经济损失。1　口蹄疫病毒和口蹄疫ＦＭＤ是由口蹄疫病毒 (ＦＭＤＶ)引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病 ,被国际兽疫局列为Ａ类动物传染病之首。易感动物包括牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼和猪等 2 0个科的 70多种家养和野生哺乳动物。猪和牛的临床表现最严重 (也有猪发病而牛不发病 ) ,羊只表现亚临床感染。在自然状态下ＦＭＤＶ可经消化道感染 ,经呼吸道感染是最主要的传播途径 ,数个感染性病毒颗粒即…     

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立

利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。     

口蹄疫病毒Mya98谱系猪源及牛源2010年分离株的分子特征及蚀斑显型比较分析

为了明确口蹄疫病毒(FMDV)Mya98谱系猪源及牛源2010年分离株的分子特征及蚀斑显型差异,对采自不同宿主的4株FMDV进行了分子特征分析和蚀斑形态的比较。结果显示,来自不同宿主动物的分子特征差异主要表现为猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2与2个牛源毒株之间具有21个特异性的氨基酸置换位点,分散在ORF范围内。猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S1具有与牛源毒株大量相似的氨基酸位点,并且与2株牛源毒株一样,都显示为小斑的蚀斑显型,而猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2在蚀斑试验中显示为大小斑混合存在。结果表明,猪源毒株O/CHN/Mya98/2010S2的变异位点对病毒蚀斑显型的改变具有重要意义。     

LncRNA TCONS_00179042对Marc-145细胞中PRRSV复制的影响

应用转染Lnc RNA TCONS_00179042过表达质粒pc DNA3.1-TCONS_00179042的Marc-145细胞,观察该Lnc RNA对PRRSV GSWW15毒株复制的影响。利用RT-PCR方法扩增出猪肺泡巨噬细胞(PAMs)被PRRSV GSWW15株感染后下调表达的Lnc RNA TCONS_00179042全长序列;通过q PCR、TCID50测定和Westernblot分析该Lnc RNA对PRRSV GSWW15株复制的影响;通过核质分离试验对PAMs细胞中Lnc RNA TCONS_00179042进行定位和半定量分析。RT-PCR检测结果显示,Lnc RNA TCONS_00179042长度约为430 bp。pc DNA3.1-TCONS_00179042过表达载体转染Marc-145细胞后,q PCR结果显示:该Lnc RNA的相对表达量约是对照组的3×105倍,表明Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中过表达。利用PRRSV GSWW15株感染过表达Lnc RNA TCONS_00179042的Marc-145细胞后,q PCR结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV RNA拷贝数约为对照组的60%;TCID50检测结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV病毒滴度显著低于对照组,约为对照组的20%;Western-blot试验结果显示:过表达Lnc RNA组PRRSV N蛋白的表达量显著低于对照组。三组数据均显示,Lnc RNA TCONS_00179042能在Marc-145细胞中抑制PRRSV GSWW15株的复制。核质分离试验结果显示,不论是细胞质还是细胞核均有Lnc RNA TCONS_00179042存在,且细胞核中的表达量大于细胞质中。本研究结果表明,该Lnc RNA能在Marc-145细胞中抑制PRRSV的复制,能作为一种抗病毒分子参与调控宿主的抗病毒反应。     

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。     

羊O/P液中Asia Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因3''端序列的分析

从宁夏中卫Asia Ⅰ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液(OPF)中扩增得到了4个口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因3'-端483 bp(VP483)片段.核苷酸和氨基酸序列比较结果表明,从4份OPF中扩增出的VP1片段,在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDV Asia Ⅰ型流行毒相比均发生了改变,由RGD变成RDD.4个扩增片段的核苷酸序列与Asia Ⅰ/JS/WX/05株相比,同源性为96.2%～98.3%,表明与Asia Ⅰ/JS/WX/05株高度同源.蛋白结构模拟结果显示,这种改变会导致G-H环柔性减弱,这可能是Asia Ⅰ/JS/WX/05 FMDV适应羊体,造成持续感染后发生的一种变异.