肝豆汤改良方调控PKR/eIF2α通路改善Wilson病模型TX小鼠突触功能障碍的机制研究

目的 探究肝豆汤改良方调控双链RNA依赖蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent pro-tein kinase,PKR)/真核细胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)通路改善Wilson病模型毒牛奶(toxic milk,TX)小鼠突触功能障碍的机制.方法 实验分为正常组、正常加肝豆汤改良方组、模型组、模型加肝豆汤改良方组,每组20只小鼠;正常组和模型组每日分2次予生理盐水灌胃,每次20 mL/kg,正常加肝豆汤改良方组与模型加肝豆汤改良方组每日分2次予中药肝豆汤改良方各20 mL/kg灌胃给药,连续4周,末次给药结束后取各组小鼠海马组织进行检测;采用旷场实验、Barnes迷宫实验检测Wilson病模型小鼠认知功能;采用TUNEL染色法检测小鼠海马组织中神经细胞凋亡情况;采用免疫荧光染色检测各组小鼠海马8-羟化脱氧鸟苷(8-hydroxylated deoxyguanosine,8-OHdG)的表达水平;采用Western blot法检测海马组织PKR/eIF2α通路以及突触相关蛋白表达水平.结果 模型组小鼠的认知功能显著低于正常组(P<0.05),模型加肝豆汤改良方组小鼠的认知功能显著高于模型组(P<0.05);与正常组比较,模型组小鼠海马神经细胞凋亡数目显著增加(P<0.05);与模型组比较,模型加肝豆汤改良方组小鼠海马神经细胞凋亡数量显著降低(P<0.05),8-OhdG表达水平显著降低(P<0.05);小鼠海马内突触相关蛋白突触蛋白1、突触素、突触后致密物-93、突触后致密物-95表达水平显著增加(P<0.05),小鼠海马PKR/eIF2α通路相关蛋白PKR、磷酸化eIF2α、转录激活因子4、促凋亡分子C/EBP同源蛋白表达水平显著降低(P<0.05).结论 肝豆汤改良方可通过调控PKR/eIF2α通路,促进突触相关蛋白表达,减轻高铜诱导的突触功能障碍,改善TX小鼠认知功能损伤症状.     

通腑养髓方治疗Wilson病疗效观察

目的 评价通腑养髓方治疗Wilson病（Wilsons disease,WD）的临床疗效。方法 将58例患者随机分为治疗组（28例,采用通腑养髓方及西医常规治疗）和对照组（30例,采用西医常规治疗）,疗程均为4周;治疗前后分别采用统一肝豆状核变性评分量表（united Wilsons disease rating scale,UWDRS）对患者肝脏症状、神经系统症状和精神症状进行评分,根据治疗前后Goldstein分级变化判定疗效,根据总胆汁酸、总胆红素、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、谷氨酰转肽酶、白蛋白水平评价两组患者治疗前后肝功能;采用日常生活能力（activities of daily living,ADL）量表评价治疗前后患者生活自理能力水平。结果 与治疗前比较,治疗组患者UWDRS Ⅰ部分、Ⅲ部分总分及UWDRS总分、标准分显著降低（P＜0.05）,且治疗组上述评分降低程度显著大于对照组（P＜0.05）;治疗组基于Goldstein 分级的临床疗效显著优于对照组（P＜0.05）;治疗组治疗后总胆汁酸复常率显著大于对照组（P＜0.05）;治疗组治疗后ADL量表评分升高程度显著大于对照组（P＜0.05）。结论 通腑养髓方可有效改善患者神经精神系统症状,改善患者日常生活活动能力,部分改善肝脏功能,明显提高临床疗效。     

基于Nrf2通路研究通腑养髓方调控Wilson病模型TX小鼠神经细胞铁死亡的机制

目的 基于核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2- related factor,Nrf2)信号通路观察通腑养髓方对Wilson病(Wilsons disease, WD)模型TX小鼠神经细胞铁死亡的干预效应,并探讨通腑养髓方对WD神经细胞损伤的保护机制。方法 以DL小鼠为正常对照,将TX小鼠随机分为模型组和通腑养髓方组,通腑养髓方组以通腑养髓方中药灌胃治疗30 d,模型组和对照组小鼠以生理盐水灌胃,末次灌胃后取各组小鼠脑组织。采用电感耦合等离子体质谱法检测小鼠脑组织铜、铁微量元素含量,免疫荧光染色技术检测小鼠脑组织转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）表达水平,比色法检测小鼠脑组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量,透射电子显微镜观察小鼠脑组织细胞线粒体形态变化,Fluoro-Jade B（FJB）染色观察小鼠神经细胞损伤程度,Western blot法检测小鼠脑组织铁死亡及Nrf2信号通路相关蛋白［Nrf2,铁蛋白重链（ferritin heavy chain,FTH1）、血红素加氧酶1（heme oxygenase 1,HO1）、醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1）］表达水平。结果 与正常对照组比较,模型组小鼠脑内铜、铁含量,TfR表达水平,MDA含量显著升高（P<0.05）,SOD活性显著下降（P＜0.05）;与模型组比较,通腑养髓方组小鼠脑内铁含量,TfR表达水平,MDA含量显著降低（P＜0.05）,SOD活性显著升高（P＜0.05）。模型组小鼠脑组织线粒体膜皱缩,嵴数量减少或消失,空泡产生;通腑养髓方组小鼠脑组织线粒体结构损伤程度明显减轻。与正常对照组比较,模型组小鼠神经细胞损伤程度显著增加（P<0.05）;与模型组比较,通腑养髓方组神经细胞损伤程度显著减少（P<0.05）。模型组小鼠脑内谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）表达水平较正常对照组显著降低（P< 0.05）,通腑养髓方组脑内GPX4表达水平较模型组显著升高（P<0.05）。模型组小鼠脑内Nrf2、FTH1、HO1、NQO1表达水平较正常对照组显著降低（P<0.05）,通腑养髓方组脑内Nrf2、FTH1、HO1、NQO1表达水平较模型组显著增加（P<0.05）。结论 通腑养髓方通过上调TX小鼠神经细胞GPX4等铁死亡相关蛋白及Nrf2、FTH1、HO1、NQO1等Nrf2通路相关蛋白的表达水平,减轻铜蓄积所致的氧化应激,抑制神经细胞铁死亡,从而起到保护神经细胞的作用。     

电针大脑中动脉闭塞模型大鼠血清减轻体外新生乳鼠神经细胞的缺糖低氧损伤的作用研究

目的 观察"电针血清"对新生乳鼠皮质神经细胞糖氧剥夺/复氧(oxygen-glucose depriva-tion and reoxygenation,OGD/R)损伤的作用.方法 将成年SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,采用电凝法复制大脑中动脉闭塞模型;7d后对各组大鼠进行腹主动脉取血,离心,抽取上清,分离新生...     

均匀设计法优选肝豆汤的效应中药配伍

目的 基于均匀设计法筛选中药复方肝豆汤保护TX小鼠神经细胞的效应中药。方法 基于“6因子11水平表”均匀设计法，以神经细胞内Bcl-2、Bax蛋白表达水平及血清和脑组织中铜含量为指标，以TX小鼠为Wilson病动物模型，采用多元逐步回归分析法优选肝豆汤中6种药物（大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草、三七）的效应中药配伍。采用Western blot法以及等离子质谱法分别测定细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和血清、脑组织铜含量。结果 与对照组比较，TX小鼠脑组织中Bcl-2表达水平显著降低（P<0.05），Bax蛋白表达水平显著升高（P<0.05），脑组织铜含量显著升高（P<0.05），血清铜含量显著降低（P<0.05）。多元逐步回归分析结果显示，姜黄和大黄分别进入血清铜含量及脑组织铜含量的回归方程，黄连和泽泻均进入脑组织Bcl-2和Bax表达水平的回归方程，姜黄和金钱草分别进入神经细胞Bcl-2/Bax的回归方程，三七均未进入上述指标的回归方程。结论 肝豆汤中大黄、姜黄、黄连、泽泻、金钱草配伍组合，可通过多靶点保护TX小鼠神经细胞；三七在保护TX小鼠神经细胞过程中未发挥明显效应。     

肝豆汤调控NLRP3炎症小体抑制Wilson病模型神经炎症的机制研究

目的 通过观察肝豆汤对Nod样受体家族含pyrin结构域蛋白3（Nod-like receptor family，pyrin domain-containing protein 3，NLRP3）炎症小体的调控作用，探究其抑制Wilson病（Wilson''s disease, WD）模型神经细胞炎症损伤的机制。方法 体外实验中，采用CuCl2诱导小胶质细胞（BV-2细胞）复制WD神经细胞损伤模型，并将BV-2细胞与海马细胞（HT-22细胞）条件培养，给予不同浓度肝豆汤含药血清。CCK-8法检测BV-2细胞及HT-22细胞活力，酶联免疫吸附法测定炎症因子水平，细胞化学法检测HT-22细胞乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）漏出水平及氧化应激水平，Western blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平。体内实验中，以TX小鼠为模型组，并以DL小鼠为正常组，肝豆汤组给予TX小鼠肝豆汤灌胃4周。采用Barnes迷宫、旷场实验、高架十字实验观察小鼠行为，苏木精—伊红染色法观察小鼠海马组织的损伤程度，Western blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平。结果 体外实验结果显示，与模型组比较，肝豆汤可抑制小胶质细胞活化，增加HT-22细胞的存活率（P＜0.05），显著降低CuCl2诱导的HT-22细胞LDH漏出水平及氧化应激水平（P＜0.05），抑制CuCl2诱导的BV-2细胞炎症因子分泌（P＜0.05），降低半胱氨酸天冬氨酸酶1、NLRP3、白细胞介素-1β、含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白表达水平（P＜0.05）。体内实验研究发现，肝豆汤可减轻WD病模型TX小鼠海马组织神经细胞损伤，改善行为学异常（P＜0.05），抑制TX小鼠海马组织NLRP3炎症小体相关分子表达水平（P＜0.05）。结论 肝豆汤通过抑制铜蓄积诱导的NLRP3炎症小体活化，减轻WD模型神经细胞炎症损伤。     

柚皮素- 铜络合物对Hep- G2细胞增殖与凋亡的影响

目的 观察柚皮素-铜络合物在体外对人肝癌Hep-G2细胞增殖与凋亡的影响，探究其作用机制。方法 将不同浓度柚皮素-铜络合物作用于体外培养的Hep-G2细胞，采用甲基噻唑基四唑法检测细胞生长抑制率；荧光显微镜下观察柚皮素-铜络合物对DAPI染色的Hep-G2细胞凋亡的影响；应用流式细胞仪检测凋亡率； Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的变化。结果 柚皮素-铜络合物可显著地抑制Hep-G2细胞增殖，且在一定的范围内呈浓度依赖性。荧光显微镜下观察显示，柚皮素-铜络合物作用的Hep-G2细胞出现显著的凋亡特征，呈剂量依赖性地增加细胞凋亡率。柚皮素-铜络合物可上调Hep-G2细胞中Bax、Caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达，且呈一定的剂量依赖性。结论 柚皮素-铜络合物可抑制Hep-G2细胞的增殖并诱导其凋亡，其作用机制可能与上调Bax、Caspase-3蛋白的表达，抑制Bcl-2蛋白的表达有关。